Periférico CD4 sangue + CD25 + CD127 baixas células T reguladoras são significativamente aumentada por tratamento Tocilizumab em pacientes com artrite reumatóide: aumento das células T reguladoras correlaciona-se com a resposta clínica Junho Kikuchi ,Misato Hashizume ,Yuko Kaneko ,Keiko Yoshimoto ,Naoshi Nishina eTsutomu Takeuchi

ARTIGO DE PESQUISA

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Periférico CD4 sangue + CD25 + CD127 baixas células T reguladoras são significativamente aumentada por tratamento Tocilizumab em pacientes com artrite reumatóide: aumento das células T reguladoras correlaciona-se com a resposta clínica

• Junho Kikuchi ,
• Misato Hashizume ,
• Yuko Kaneko ,
• Keiko Yoshimoto ,
• Naoshi Nishina e
• Tsutomu Takeuchiemail autor

Arthritis Research & Therapy201517 : 10

DOI: 10,1186 / s13075-015-0526-4

© Kikuchi et al .; licenciado BioMed Central. 2015

Recebido: 15 de agosto de 2014

Aceito: 12 de janeiro de 2015

Publicação: 21 de janeiro de 2015

Abstrato

Introdução

Tocilizumab (TCZ), um anticorpo anti-receptor de interleucina-6, é clinicamente eficaz contra a artrite reumatóide (RA), e vários relatórios têm indicado como TCZ influencia um número de mecanismos subjacentes patogénese da AR. No entanto, ainda não está claro se TCZ afeta células inflamatórias no sangue periférico e se tais alterações estão associadas com a resposta clínica. Foram avaliadas as associações entre as proporções de subconjuntos de células imunitárias periféricas e resposta clínica em pacientes com AR tratados com TCZ.

Métodos

Trinta e nove pacientes consecutivos com AR que começaram a receber TCZ como sua primeira biológica entre março de 2010 e abril de 2012, foram inscritos. As proporções de vários subconjuntos de células periféricas com os seus níveis de expressão de marcadores de diferenciação, e marcadores de activação de moléculas co-estimuladoras foram medidas sequencialmente a partir da linha de base até à semana 52 por análise de citometria de fluxo.

resultados

Clinical Disease Activity Index (CDAI) remissão foi alcançada em 53,8% dos pacientes na semana 52 da terapia TCZ. As proporções de células CD4 + CD25 + CD127 baixas células T reguladoras (T Reg ) e HLA-DR + T activadas reg células aumentou significativamente com terapia TCZ ( P  <0,001 e P  <0,001, respectivamente), enquanto as proporções de células CD3 + CD4+ CXCR3 - CCR6 + CD161 + células T helper 17 não se alterou ao longo dos 52 semanas. As proporções de CD20 + CD27 +células B de memória, HLA-DR + CD14 + e CD69 + CD14 + em monócitos activados, e CD16 + CD14 + monócitos diminuiu significativamente ( P  <0,001, P  <0,001, P  <0,001 e P  <0,001, respectivamente). Entre eles, apenas a alteração no T regcélulas foi inversamente correlacionada com a mudança na pontuação CDAI (ρ = -0,40, P  = 0,011). O aumento mais dinâmica em T- reg células foi observada no grupo de remissão CDAI ( P  <0,001).

Conclusão

Este estudo demonstra que TCZ afetados proporções de circulando células do sistema imunológico em pacientes com AR.A proporção de t reg células entre células CD4 + células bem correlacionados com a resposta clínica.

Introdução

Células T (especialmente células CD4 + células T), os monócitos e as células B são considerados para ser envolvido na patogénese da artrite reumatóide (RA) [ 1 ]. Frequentemente considera-se que a diminuição do número e / ou actividade de linfócitos e outras células do sistema imune por tratamento da AR pode reduzir a actividade da doença. A primeira evidência disso foi visto em ensaios clínicos preliminares em que visam CD4 + células T com anticorpos monoclonais anti-CD4 (mAbs) resultou em melhora clínica da AR, embora apenas modestamente [ 2 ]. Abatacept, um T de antigénio de linfócitos a proteína de fusão recombinante 4 imunoglobulina citotóxico que inibe de CD4 + activação das células T por bloqueio de co-estimulação com células apresentadoras de antigénio, tais como as células B e monócitos, demonstrou eficácia clínica contra o AR e tem sido aprovado em todo o mundo para o tratamento da AR [ 3 ]. A depleção de células B periféricas por o rituximab anticorpo anti-CD20, também melhora a actividade da doença [ 4 ].

O anti-receptor de interleucina-6 (IL-6R) do anticorpo Tocilizumab (TCZ) também é clinicamente eficaz contra RA [ 5 ]. Vários estudos demonstraram que o bloqueio da sinalização de IL-6 com TCZ pode afectar proporções de células do sangue periférico. Dado que a IL-6 foi originalmente identificada como um factor de diferenciação de células B [ 6 , 7 ], não é surpreendente que afecta TCZ proporções de populações de células B em pacientes com AR. A IL-6 também influencia a diferenciação de células T em células T efectoras (T H 1, T H 2 e T H 17 células) ou as células T reguladoras (T reg ) [ 8 - 10 ].Em estudos recentes, investigadores têm mostrado que a IL-6 bloqueio poderia afectar favoravelmente o T H 17 / t Regdesequilíbrio de células em pacientes com AR [ 11 , 12 ]. Além disso, a IL-6 parece afectar a proliferação e a activação de monócitos que expressam IL-6R [ 13 , 14 ]. No entanto, porque, em estudos anteriores, o número de pacientes, a duração dos estudos e as populações de células examinadas estavam limitados, não é claro se existe uma população chave de células imunitárias periféricas que atenua os sintomas clínicos RA através de terapias anti-IL-6R [ 11 , 12 , 15 ]. Se essas relações podem ser esclarecidas, permitiria pesquisadores médicos para compreender a patogênese da AR do ponto de vista das populações de linfócitos e encontrar marcadores substitutos a fim de escolher uma estratégia terapêutica ideal para a RA.

O objectivo primário deste estudo foi avaliar vários tipos diferentes de células do sangue periférico por meio de análise de citometria de fluxo para identificar populações modulados por terapia anti-IL-6R. O objectivo secundário foi determinar se qualquer uma dessas populações está fortemente associada com várias medidas clínicas em resposta à terapia anti-IL-6R.

Métodos

Pacientes

Os pacientes elegíveis foram aqueles que preencheram os critérios revistos de 1987 do American College of Rheumatology (ACR) para a classificação de RA ou os 2010 ACR / Liga Europeia contra o Reumatismo (EULAR) critérios de classificação [ 16, 17 ]. Pacientes consecutivos no nosso instituto que iniciaram TCZ como seu primeiro agente biológico entre março de 2010 e abril de 2012, foram inscritos. Todos eles apresentaram resposta insuficiente para pelo menos uma droga convencional sintético anti-reumático modificadores da doença (csDMARD). Os pacientes inscritos foram administradas de 8 mg / kg a cada 4 semanas TCZ, com ou sem outros csDMARDs, incluindo o metotrexato (MTX). O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética na Keio University School of Medicine e foi realizado em conformidade com a Declaração de Helsínquia e Boas Práticas Clínicas. Consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.

avaliação e avaliação da eficácia clínica

características demográficas e clínicas, incluindo idade, sexo, duração da doença, contagem de articulações concurso (TJC), inchada contagem de articulações (SJC), avaliação global do paciente (paciente escala visual analógica (Pt-VAS)), avaliação global pelo médico (escala visual analógica do médico ( D-VAS)), Avaliação do Questionário de Saúde Índice de Incapacidade (HAQ-DI) pontuação, proteína C-reativa (CRP) de nível, taxa de sedimentação de eritrócitos (ESR), (-3 MMP) nível de metaloproteinase-3, fator reumatóide (FR) valor e valor anticorpo anticíclica peptídeo citrullinated (CCP) foram obtidos a partir dos prontuários dos pacientes.

A atividade da doença foi avaliada utilizando o Índice Clínico de Atividade de Doença (CDAI) e Índice de Atividade da Doença Simplificado (SDAI). Os valores de corte para a remissão, a baixa atividade da doença (LDA), atividade da doença moderada (MDA) e alta atividade da doença (HDA) foram os seguintes: para a remissão, CDAI ≤2.8, SDAI ≤3.3; para LDA, 2,8 <CDAI ≤ 10, 3,3 <SDAI ≤ 11; para MDA, 10 <CDAI ≤ 22, 11 <SDAI ≤ 26; e para HDA, CDAI> 22, SDAI> 26 [ 18 ].

coloração da superfície celular e citometria de fluxo de análise

células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram obtidos no início do estudo e nas semanas 24 e 52 do tratamento TCZ. As PBMC foram separadas por gradiente de densidade com Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) e criopreservadas em CELLBANKER 1 (Nippon Zenyaku Kogyo, Fukushima, Japão) até à sua utilização. As células descongeladas foram coradas durante 30 minutos à temperatura ambiente sob condições de escuridão, com os seguintes mAbs marcados com fluoróforo: anti-CD4-VioGreen (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha); anti-CD3-Pacific Blue / isotiocianato de fluoresceína (FITC), CD8-anti-Pacific Blue, anti-CD14- (APC) -Cy7, anti-CD20-cianina 7 aloficocianina (APC-Cy7), anti-CD25 ficoeritrina (PE) -Cy5, anti-CD27-PE-Cy7, anti-CD38-PE-Cy5 anti-CD45RO-PE-Cy7, anti-CD56-PE / PE-Cy7, anti-CD69-APC / PE-Cy7, anti-CD80 -FITC, anti-CD86-PE-Cy5 anti-CD127-FITC, anti-CD161-APC, anti-quimioquina (motivo CXC) do receptor 3 (CXCR3) -PE e anti-HLA-DR-APC / APC-Cy7 ( todos os produtos da BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA); -Anti-CD16 violeta brilhante 510 e anti-violeta brilhante CCR6 421 (ambos de BioLegend, San Diego, CA, EUA); e anti-imunoglobulina de ratinho G controlos do mesmo isotipo (VioGreen de Miltenyi Biotec, os outros a partir de BD Biosciences).

As células coradas foram lavadas duas vezes com 2 ml de solução salina tamponada com fosfato e analisadas num analisador MACSQuant (Miltenyi Biotec). As células mortas foram confirmados com uma solução de iodeto de propidio de fluorescência (Miltenyi Biotec) e excluídos com base em sinais de dispersão. Os subconjuntos analisados ​​foram células T CD4 e CD8 (incluindo a memória, efectora e marcadores de activação) e T H 1, T H 2, T H 17, T reg , células B, células assassinas naturais, e monócitos, incluindo os seus sub-populações e marcadores de activação . As subpopulações de células periféricas identificados neste estudo foram definidos por meio de marcadores de superfície celular com base em subconjuntos de células periféricas descritos em um relatório anterior (arquivo adicionais 1 : Tabela S1) [ 19 ].

análise estatística

Os dados contínuos são apresentados como mediana e intervalo interquartil (IQR) ou como um número com valor percentual, conforme o caso. O teste de Wilcoxon e Kruskal-Wallis foram utilizados para examinar as diferenças entre variáveis ​​contínuas. Correlação de duas variáveis ​​contínuas foi analisada pelo coeficiente de correlação de Spearman. O teste exato de Fisher foi utilizado para comparar a proporção de dados categóricos entre os grupos. A P -valor <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas com 10 JMP (SAS Institute, Cary, NC, EUA).

resultados

As características basais dos pacientes e associações entre as populações de células periféricas e atividade da doença no início do estudo

Tabela  1 mostra os dados demográficos de base e características clínicas dos pacientes inscritos ( N  = 39). Nesta população, não houve diferença entre TCZ monoterapia e TCZ em combinação com MTX em termos de características de base.

tabela 1

Demografia basal do paciente e características clínicas de

As características dos pacientes, N   = 39	Média ± DP ou N (%)	Mediana (IQR)
Idade, yr	54,8 ± 13,3	56 (44 a 63)
Feminino, n (%)	35 (89,7)	-
A duração da doença, yr	4,7 ± 3,3	4,5 (1,7 a 8,0)
SJC (variação de 0 a 28)	5,8 ± 3,8	5 (3-7)
TJC (variação de 0 a 28)	5,0 ± 3,5	4 (3-6)
Pt-VAS (score / 100 mm)	46,2 ± 24,5	45 (30 a 63)
D-VAS (score / 100 mm)	42,3 ± 16,7	39 (32 a 54)
pontuação CDAI	19,6 ± 9,3	17,5 (12,0-25,2)
pontuação SDAI	21,1 ± 9,9	19,8 (13,4-26,9)
pontuação HAQ-DI	1,0 ± 0,7	1 (0,5 a 1,5)
CRP, mg / dl	1,4 ± 1,6	0,7 (0,2 a 2,2)
ESR, mm / h	48,1 ± 32,0	46 (19 a 68)
MMP-3, ng / mL	158,5 ± 147,7	100,2 (60,0-221,0)
RF-positivas, n (%)	33 (84,6)	-
ACPA-positivas, n (%)	33 (84,6)	-
Metotrexato concomitante, n (%), a dose, b mg / semana	12 (30,8), 8,0 ± 1,2	-, 8,0 (7,6 a 8,0)
Glucocorticóide concomitante, n (%), a dose, b mg / dia	10 (25,6), 5,1 ± 2,8	-, 5 (3 a 5)

um anticorpo proteína ACPA, Anticitrullinated; CDAI, Clínica Índice de Atividade da Doença; CRP, proteína C-reativa; D-VAS, escala visual analógica do doutor; ESR, taxa de sedimentação de eritrócitos; HAQ-DI, Avaliação Health Questionnaire Disability Index; MMP-3, metaloproteinase de matriz-3; Pt-VAS, escala visual analógica do paciente; RF, o fator reumatóide; SDAI, Doença simplificado Índice de Atividade; SJC, contagem de articulações inchadas; TJC, Tender contagem de articulações. B Média ± desvio padrão (SD) e mediana (intervalo interquartil (IQR)) entre os pacientes que recebem medicamentos.

No início do estudo, uma proporção maior de HLA-DR + CD8 + células T entre os CD8 + células T foi significativamente associada com maior CRP, Pt-VAS, SDAI e HAQ-DI, bem como uma maior proporção de ingênua e memória CD8 + as células T CD8 entre os + células T, foi significativamente associada com RF, ACPA, SJC, CDAI e SDAI (arquivo adicionais 1 : Tabela S2).A maior proporção de T H 2 células entre os CD4 + células T também foi significativamente associada com TJC, D-VAS, Pt-VAS, CDAI e dezenas SDAI. Nenhum outro subconjuntos de linha de base ou marcadores de superfície correlacionadas com CDAI ou pontuação SDAI (arquivo adicionais 1 : Tabela S3).

Alterações da linha de base na resposta clínica

Todos os pacientes neste estudo receberam TCZ para toda a 52 semanas. As pontuações CDAI e SDAI (média ± desvio padrão) diminuiu significativamente de 19,6 ± 9,3 e 21,1 ± 9,9, respectivamente, no início do estudo para 5,5 ± 5,2 e 5,5 ± 5,2 na semana 24 e para 5,2 ± 6,0 e 5,6 ± 6,8 na semana 52 ( P  <0,0001). O número ea percentagem de pacientes classificados como tendo atingido a remissão ou como tendo LDA, MDA e HDA foram os seguintes CDAI e SDAI: no início do estudo, 0 (0%) 0 (0%) para a remissão, 3 (7,7%) e 4 (10,3%) de LDA, 24 (61,5%) e 25 (64,1%) de MDA, e 12 (30,8%) e 10 (25,6%) de HDA, respectivamente; e na semana 52, 21 (53,8%) e 22 (56,4%) para a remissão, 11 (28,2%) e 10 (25,6%) de LDA, 7 (17,9%) e 7 (17,9%) de MDA, e 0 ( 0%) e 0 (0%) para HDA, respectivamente (arquivo adicionais 1 : Figura S2).

Alterações da linha de base em subpopulações de células periféricas

As proporções de memória de CD4 + células T entre todas as células CD4 + células T, HLA-DR + CD8 + células T entre CD8 +células T, T reg células entre células CD4 + células T, HLA-DR + T reg células entre T reg células, células naive B entre todas as células B, CD16 e - CD14 + monócitos entre CD14 + monócitos aumentou após o tratamento TCZ (Tabelas  2 e 3 ). Por outro lado, as proporções de células CD4 naive + células T entre todas as células CD4 + células T, HLA-DR + CD4 + células T entre CD4 + células T, CD86 + células B entre todas as células B, as células B de memória entre todas as células B , HLA-DR + CD14+ monócitos entre CD14 + monócitos, CD69 + CD14 + monócitos entre CD14 + monócitos, e CD16 + CD14 + monócitos entre CD14 + monócitos diminuíram após o tratamento TCZ (Tabelas  2 e 3 ). Os outros subgrupos e seus marcadores de ativação não foram significativamente alteradas durante a terapia TCZ.

mesa 2

As alterações nas proporções de subconjuntos e marcadores de superfície das células T durante o tratamento Tocilizumab

Subconjuntos e marcadores de superfície	Mediano (intervalo interquartil)			Linha de base versus semana 52
	linha de base	semana 24	semana 52	P- valor
CD4 + células T / linfócitos	53,6 (47,3-59,4)	53,4 (47,3-58,4)	55,3 (49,5-60,5)	0,345
CD4 naive + células T CD4 / + células T	61,8 (57,7-69,3)	59,1 (53,7-62,2)	59,1 (51,8-61,8)	0,019 *
Memória de CD4 + células T CD4 / + células T	30,7 (30,7-42,3)	40,9 (37,8-46,3)	40,9 (38,2-48,2)	0,010 *
HLA-DR + CD4 + células T CD4 / + células T	3,2 (2,7-4,1)	3,1 (2,6-3,9)	2,6 (2-3,1)	0,005 *
CD38 + CD4 + células T CD4 / + células T	32,4 (26,3-38,5)	32,4 (28,4-39,4)	32,6 (29,3-40,1)	0,212
CD69 + CD4 + células T CD4 / + células T	0,1 (0-0,1)	0,1 (0-0,2)	0,1 (0,1 a 0,3)	0,016 *
CD8 + de células T / linfócitos	32,4 (28,4-38,1)	30,8 (26,9-37,1)	29,1 (26,4-33,1)	0,052
CD8 naive + células T / CD8 + de células T	60,8 (57,7-64,3)	62,1 (59,5-67,5)	62,7 (59,5-67,5)	0,087
Memória CD8 + de células T / CD8 + de células T	39,2 (35,7-42,3)	37,9 (33,9-41,5)	37,3 (32,5-40,5)	0,087
HLA-DR + CD8 + de células T / CD8 + de células T	16,4 (13,4-19,4)	18,3 (14,3-19,4)	19,4 (17,3-21,4)	0,005 *
CD38 + CD8 + de células T / CD8 + de células T	25,2 (15,9-36,7)	26,1 (19,3-31,4)	24,5 (19,4-30)	0,727
CD69 + CD8 + de células T / CD8 + de células T	1,3 (0,5 a 2,1)	1,3 (0,9-2,1)	0,9 (0,3 a 1,3)	0,057
T reg / CD4 + células T	3,6 (2,2-4,3)	4,2 (2,6-5,2)	5,6 (4,5-7,1)	<0,001 *
Naïve T reg / T reg células	52,8 (44,0-59,0)	47,7 (42,6-54,9)	49,6 (46,5-55,7)	0,242
T de memória reg / T reg células	47,2 (41-56,1)	52,3 (45,1-57,4)	50,4 (44,3-53,5)	0,242
HLA-DR + T reg / T reg células	14 (11,7-17,7)	16,8 (14,3-20,3)	18,4 (15,4-19,4)	<0,001 *
T H 1 / CD4 + células T	19 (14,8-20,8)	17,4 (15,3-19,3)	20,7 (15,9-22,9)	0,095
HLA-DR + T H 1 / T H 1 células	4,5 (3,4-5,7)	4,5 (3,4-5,7)	3,5 (2,2-5,6)	0,119
T H 2 / CD4 + células T	46,8 (37,7-54,3)	51,8 (42,5-58,7)	43,3 (34,6-49,1)	0,179
HLA-DR + T H 2 / T H 2 células	2,0 (1,2-3,1)	2,3 (1,9-2,9)	2,2 (1,8-2,9)	0,174
T H 17 / CD4 + células T	2,0 (0,78-3,2)	2,0 (1,4-3,2)	2,0 (1,5-3,6)	0,342
HLA-DR + T H 17 / T H 17 células	4,0 (3,4-4,4)	3.6 (3.1 a 4.1)	3,9 (3,3-4,2)	0,323

* diferenças significativas determinada utilizando-correspondida pares de Wilcoxon-rank assinado teste.

tabela 3

As alterações nas proporções de subconjuntos e marcadores de superfície de células B, células assassinas naturais e monócitos durante o tratamento Tocilizumab

Subconjuntos e marcadores de superfície	Mediano (intervalo interquartil)			Linha de base versus semana 52
	linha de base	semana 24	semana 52	P -valor
células B / linfócitos	3,2 (2-5,1)	4.1 (3.1 a 5.2)	4.1 (3.1 a 5.2)	0,118
CD80 + células B / células B	26,9 (13,5-32)	19,3 (12,4-26,3)	19,3 (13,2-21,4)	0,045 *
CD86 + células B / células B	42,5 (36,5-47,6)	34 (29,2-38,1)	36,7 (32,1-41,9)	0,009 *
HLA-DR + células B / células B	99,6 (99-99,8)	99,4 (98,8-99,8)	99,5 (99,3-99,8)	0,833
células B naïve células / B	52 (43,1-60,3)	62,7 (52,7-68,2)	66,7 (57,6-74,6)	<0,001 *
células B de memória células / B	48 (39,7-56,9)	37,3 (31,8-47,3)	33,3 (25,4-42,4)	<0,001 *
células NK / linfócitos	24,1 (20,0-27,5)	25,8 (21,2-30,5)	24,5 (20,9-29,5)	0,401
CD80 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos	0,2 (0,1 a 0,3)	0,2 (0,1 a 0,3)	0,2 (0,1 a 0,3)	0,433
CD86 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos	99,6 (99,2-99,9)	99,7 (99,3-99,9)	99,8 (99,6-99,9)	0,054
HLA-DR + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos	99,5 (89,3-99,8)	98,2 (89,7-99,6)	94,6 (86-95,8)	0,004 *
CD69 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos	66,7 (60,6-74,8)	48,3 (35,8-70,1)	34 (26,2-56,9)	<0,001 *
CD16 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos	16 (10,3-20,9)	8,6 (4,5-12,6)	8,1 (3,8-12,9)	<0,001 *
CD16 - CD14 + monócitos / CD14 + monócitos	84 (79,1-89,7)	91,4 (87,4-95,5)	91,9 (87,1-96,2)	<0,001 *

* Diferenças significativas usando-correspondida pares de Wilcoxon-rank assinado teste.

Avaliação das relações entre subpopulações de células periféricas e resposta clínica após a terapia tocilizumab

As associações entre as alterações em subconjuntos de células periféricas e alterações em parâmetros clínicos (ΔCDAI e ΔSDAI) após tratamento TCZ estão resumidos na Tabela  4 . Observou-se uma correlação significativa entre a alteração na proporção de T reg células entre CD4 + células T e as mudanças na pontuação CDAI desde o início até a semana 52: quanto maior o aumento na proporção de T reg células entre CD4 + células T da linha de base semana 52, maior a melhoria na pontuação CDAI durante o mesmo período (ρ = -0,346, P  = 0,031). Além disso, a alteração na expressão de CD38 em células CD8 + de células T mais de 52 semanas foi negativamente correlacionado com a alteração na pontuação CDAI (ρ = -0,355, P  = 0,026). Os outros subconjuntos de células periféricas, incluindo CD4 naive e de memória + células T, HLA-DR +CD4 + células T, CD69 + CD4 + células T, HLA-DR + CD8 + células T, HLA-DR + T reg ingénuos e B de memória células, CD86 +células B, HLA-DR + CD14 + monócitos, CD69 + CD14 + monócitos, CD16 + CD14 + monócitos e CD16 - CD14 + monócitos, as proporções dos que mudaram significativamente ao longo de 52 semanas (como mostrado acima), não demonstrou qualquer correlação com a mudança na pontuação CDAI. Os mesmos resultados foram encontrados quando ΔSDAI foi utilizado como o ponto final clínico.

tabela 4

Correlações de mudanças nas atividades de doença com alterações nos subconjuntos de células periféricas e marcadores de superfície após 52 semanas de tratamento com tocilizumab um

	ΔCDAI		ΔSDAI
subconjunto	P -valor	ρ de Spearman	P -valor	ρ de Spearman
ΔCD4 + células T / linfócitos	0,273	0,180	0,342	0,156
ΔNaïve de CD4 + células T CD4 / + células T	0,653	-0,074	0,481	-0,116
ΔMemory de CD4 + células T CD4 / + células T	0,653	0,074	0,481	0,116
ΔHLA-DR + CD4 + células T CD4 / + células T	0,829	-0,036	0,710	-0,061
ΔCD38 + CD4 + células T CD4 / + células T	0,231	-0,196	0,089	-0,276
ΔCD69 + CD4 + células T CD4 / + células T	0,746	-0,054	0,476	-0,118
ΔCD8 + células T / linfócitos	0,698	-0,064	0,294	-0,172
ΔNaïve CD8 + de células T / CD8 + de células T	0,555	0,097	0,256	0,186
ΔMemory CD8 + de células T / CD8 + de células T	0,555	-0,097	0,256	-0,186
ΔHLA-DR + CD8 + de células T / CD8 + de células T	0,566	-0,095	0,955	0,009
ΔCD38 + CD8 + de células T / CD8 + de células T	0,026 *	-0,355	0,036 *	-0,337
ΔCD69 + CD8 + de células T / CD8 + de células T	0,686	-0,067	0,357	-0,152
AT reg / CD4 + células T	0,031 *	-0,346	0,033 *	-0,342
ΔNaïve T reg / T reg	0,930	0,015	0,612	0,084
ΔMemory T reg / T reg	0,924	-0,016	0,606	-0,085
ΔHLA-DR + T reg / T Reg	0.270	-0,181	0,279	-0,178
AT H 1 / CD4 + células T	0,847	-0,032	0,915	-0,018
ΔHLA-DR + T H 1 / T H 1	0,969	0,007	0,732	0,057
AT H 2 / CD4 + células T	0,354	0,153	0,312	0,166
ΔHLA-DR + T H 2 / T H 2	0,291	-0,173	0,152	-0,234
AT H 17 / CD4 + células T	0,593	-0,088	0,442	-0,127
ΔHLA-DR + T H 17 / T H 17	0,366	-0,149	0,229	-0,197
células ΔB / linfócitos	0,958	-0,009	0,709	-0,062
ΔCD80 + células B / células B	0.740	0,055	0,546	0,100
ΔCD86 + células B / células B	0,210	0,206	0,065	0,299
ΔHLA-DR + células B / células B	0,838	-0,034	0,841	-0.033
células ΔNaïve células B / B	0,291	-0,174	0,306	-0,168
células ΔMemory células B / B	0,291	0,174	0,306	-0,168
células ΔNK / linfócitos	0,559	0,097	0,506	0,110
ΔCD80 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos	0,645	-0,076	0,699	-0,064
ΔCD86 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos	0,440	0,127	0,776	0,047
ΔHLA-DR + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos	0,415	-0,134	0,138	-0,242
ΔCD69 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos	0,430	-0,130	0,258	-0,186
ΔCD16 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos	0,120	-0,253	0,203	-0,208
ΔCD16 - CD14 + monócitos / CD14 + monócitos	0,121	0,253	0,204	0,208

um CDAI, Clinical Disease Activity Index; HLA, antígeno leucocitário humano; NK, assassino Natural; SDAI, Doença simplificado Índice de Atividade; T H , célula T auxiliar; T reg , de células T reguladoras. * Correlação significativa por meio do coeficiente de correlação de Spearman.

Associação entre a alteração no T reg células e a eficácia da terapia tocilizumab

O decurso de tempo das alterações no T reg células como uma proporção de células T CD4 + células T é mostrado na Figura 1 A. A proporção média de T reg células aumentou significativamente ao longo de 52 semanas a partir de 3,6 (IQR, 2,2-4,3) para 5,6 (IQR 4,5-7,1) ( P  <0,001). A mudança na pontuação CDAI e SDAI na semana 52 foi significativamente associada com a mudança de T reg células na semana 52 (Tabela  4 , Figura  1 B). Dos 39 pacientes examinados neste estudo, 21 (53,8%) preencheram os critérios de CDAI para a remissão e 22 (56,4%) alcançaram remissão SDAI à semana 52. Quando dividimos os pacientes em dois grupos de acordo com seu estado de remissão na semana 52, a mudança na T de sangue periféricoreg células foi significativamente maior no grupo de remissão do que no grupo nonremission na semana 52 (Figura  1 C).Além disso, a proporção de T do sangue periférico reg células foi significativamente maior no grupo de remissão do que no grupo nonremission na semana 52 (Figura  1 D).

figura 1

As relações entre os efeitos de Tocilizumab sobre a proporção de células T reguladoras e respostas clínicas. (A) a mudança cronológica na proporção de T reguladoras (T reg células entre CD4) + células T a partir da linha de base até a semana 52 de tocilizumab tratamento (TCZ). (B) As relações entre a mudança de atividades clínicas (Clinical Índice de Atividade de Doença ( Índice ΔCDAI) e simplificado de atividade de doença (ΔSDAI)) ea mudança na proporção de T reg células entre as células T CD4 + (ATreg / CD4) na semana 52. (C) as relações entre pontuações CDAI e SDAI na semana 52 e a mudança na proporção de T reg células entre CD4 + células T (AT reg / CD4) na semana 52. (D) as relações entre pontuações CDAI e SDAI na semana 52 e a proporção de Treg células entre CD4 + células T na semana 52. as praças significam medianas e intervalos interquartis, e os diamantes significam médias e intervalos de confiança de 95%. Os dados foram analisados ​​utilizando o teste de Kruskal-Wallis (A) , o coeficiente de correlação de Spearman (B) e o teste de soma de postos de Wilcoxon (C, D) . *Diferenças significantes.

Quanto a expressão de CD38 em células CD8 + de células T, a expressão global não se alterou durante 52 semanas ( P  = 0,913), e não houve diferença na proporção entre os grupos de remissão e nonremission na Semana 52 ( P  = 0,453 para CDAI, P  = 0,345 para SDAI).

Discussão

Neste artigo, relatamos os resultados do primeiro estudo abrangente para mostrar o efeito da TCZ em vários subconjuntos de células periféricas. Neste estudo, demonstrámos que a proporção de células T CD4 + CD25 + CD127 baixo t reg células entre células CD4 + células e a proporção de HLA-DR + -activated T reg células T entre reg células aumentou significativamente a partir da linha de base ao longo do curso do tratamento com TCZ, e também que as proporções de CD20 + CD27 + células B de memória, HLA-DR + CD14 + em monócitos activados, de CD69 + CD14 + em monócitos activados, e CD16 + CD14 + monócitos não clássicos diminuiu significativamente a partir da linha de base. Entre eles, apenas o aumento em T- reg células foi significativamente associada com a realização de remissão pelo tratamento TCZ.

Estudos relacionados têm relatado o aumento da T reg níveis de células de 1 ano após a administração TCZ em uma pequena população [ 20 ], durante 3 meses [ 15 ] e até 6 meses [ 12 ]. Embora definições de T reg células do nosso estudo, usando apenas marcadores da superfície celular, sem modificação estimulador para as células in vitro , foram diferentes daquelas nestes estudos anteriores, nossos resultados mostraram as mesmas tendências como publicado anteriormente.O mecanismo é uma questão que ainda não está totalmente compreendido. No entanto, isso ainda é um biomarcador importante, já que nenhum biomarcador adequado que pode ajudar a prever o resultado da RA não foi identificado.

Vários mecanismos podem contribuir para a potenciação de T reg células por terapia TCZ. É concebível que a IL-6 tem um efeito sobre o t Reg diferenciação através da inibição da expressão de um factor de transcrição específico, FoxP3 [ 21 , 22 ].Isto pode sugerir um mecanismo pelo qual a neutralização de IL-6 de sinalização em doentes com AR pode induzir um aumento no número e a função de T reg células. O aumento quantitativo em T- reg células que expressam níveis elevados de antigénio de leucócitos humanos (HLA) -DR em pacientes com AR tratados com TCZ também poderia ser um resultado da activação e proliferação de preexistente T reg células ou da sua diferenciação por conversão de Foxp3 - precursores .

Uma questão que se coloca é o resultado de se o aumento de T Reg proporção após a terapia TCZ é um resultado de remissão da doença ou é atribuível ao uso de TCZ. Para responder à pergunta, nós também analisados ​​T periférica regcélulas em 12 pacientes com RA longitudinalmente tratados com MTX sozinho (arquivo adicionais 1 : Tabela S4). Todos os pacientes obtiveram LDA ou de dispensa na semana 52 após o início do tratamento com MTX (arquivo adicionais 1 : Figura S3). A proporção de T reg células não mostram uma certa tendência ou mudança de mais de 52 semanas após a administração de MTX ( P  = 0,729) (arquivo adicionais 1 : Figura S4A). Além disso, a mudança de T reg células na semana 52 não foi associada com a mudança na pontuação CDAI e SDAI na semana 52 (arquivo adicionais 1 : Figura S4B). Estes resultados sugerem que, embora a comparação em um pequeno número de pacientes com MTX, o aumento do T Regproporção após a terapia TCZ não é um resultado de remissão da doença, mas causada por terapia TCZ si.

Outra questão é se outros agentes biológicos para o tratamento RA também induzem T reg células. Tem sido relatado que nem adalimumab, um factor anti-necrose tumoral (anti-TNF) mAb, nem o etanercept, um receptor de TNF solúvel, percentagens modificados ou números absolutos de circulantes CD4 + CD25 alta T reg células ou outras T reg fenótipos depois de ser administrada durante 6 e 12 semanas para os pacientes com AR, independentemente da sua resposta [ 23 ].No entanto, existe um relatório que altas concentrações de TNFa pode bloquear as funções imunossupressores de T regcélulas in vitro e que o tratamento de doentes com RA com infliximab, um anti-TNF mAb, reforça T Reg supressão da proliferação de células efectoras [ 24 ]. Supõe-se que estes resultados conflituosos pode ser atribuída a um pequeno número de indivíduos ( N  = 10 a 30) e um período de observação curto (12 a 24 semanas). Em relação abatacept, a terapia diminui o número absoluto de T reg células, mas aumenta a sua função em pacientes com AR [ 25 ]. É concebível que os diferentes alvos destas terapias influenciar o desempenho diferente de T reg células e que os resultados do presente estudo indicam uma parte do mecanismo único de TCZ.

Embora ainda há muito a ser esclarecido sobre como T reg defeitos podem contribuir para a patogênese da AR, aproxima-se especificamente impulsionar T reg atividade pode ser útil no tratamento da AR. Neste estudo, a alteração em T Reg foi correlacionada com a actividade da doença após a terapia TCZ. Esta é a primeira vez que o efeito do aumento da T Reg tem sido mostrado para ser rigorosamente relacionado com a eficácia clínica.

Os efeitos da IL-6 no final da fase de diferenciação da célula B in vitro são bem documentadas [ 26 ]. In vivo de IL-6 sobre-expressão está associada a hiperactividade das células B, produção de auto-anticorpos e imunopatologia [ 27 , 28 ]. Em pacientes com AR, a activação crónica de células B e uma acumulação de células B de memória no sangue periférico e as membranas sinoviais têm sido descritas [ 29 , 30 ]. Dentro deste contexto, as terapias alvo de células B utilizando rituximab têm sido amplamente explorado na AR. Uma vez que a IL-6 tem sido descrito como um importante factor de estimulação de células B, com efeitos sobre a sobrevivência das células B de memória e sobre a diferenciação das células no plasma e a sobrevivência na medula óssea, é fácil de compreender o efeito da TCZ em células B periféricas, especialmente o proporção de células B virgens de células de memória B [ 31 ]. Embora a proporção de células B de memória diminuiu significativamente ao longo de 52 semanas de terapia TCZ, não se correlacionou com nenhum componente do status de atividade, SJC, TJC, Pt-VAS, D-VAS, PCR e VHS. Portanto, a redução pode ser atribuída ao efeito da terapia TCZ em vez de para a actividade da doença. Quando comparamos a proporção de subconjuntos de células B nos mesmos 12 pacientes que foram efetivamente tratados apenas com MTX durante 52 semanas como mencionado acima (arquivo adicionais 1 : Tabela S5), observou-se que a proporção de células B de memória tende a diminuir em pacientes com o tratamento com MTX, como no caso com TCZ, sugerindo que a tendência não era específico para a terapia TCZ. No entanto, as proporções de CD80 + e CD86 + células B entre todas as células B não se alterou em pacientes que receberam tratamento com MTX.Por conseguinte, a diminuição da proporção após a terapia TCZ pode ser característica de TCZ.

No sangue periférico, duas subpopulações de monócitos com propriedades funcionais distintas foram definidas pela sua expressão de moléculas CD14 e CD16. Comparado com CD14 clássica + CD16 - monócitos, CD16 + monócitos não clássicos têm mostrado possuir várias características de macrófagos teciduais inflamatórias, nomeadamente, maior expressão do complexo de histocompatibilidade principal antigénios da classe II e várias moléculas de adesão e menor expressão de IL-10, de crescimento transformante β fatores, macrófagos fator estimulante de colônias, IL-1b e TNF? [ 32 ]. A importância fisiopatológica do CD16 + subconjunto de monócitos não clássica foi demonstrada pela sua expansão sob várias condições inflamatórias, tais como a AR, sépsis, asma e tumores sólidos. Nós demonstramos que TCZ reduziu o nível periférico de CD16 + monócitos não clássicos. Embora ainda não se esclareceu como monócitos diferenciam-se em CD16 + monócitos não-clássicas, este estudo revelou que a IL-6 parece estar envolvido na proliferação de CD16 + monócitos não-clássicas ou mudar o equilíbrio de monócitos ao CD16 + monócitos não-clássicas. Nos mesmos 12 pacientes com AR descrito acima, que foram tratados com MTX sozinho, as proporções de HLA-DR + CD14 + monócitos e CD69 + CD14 + monócitos entre todos os monócitos não se alterou (arquivo adicional 1 : Tabela S5), que era diferente a partir dos resultados para TCZ. A diminuição dos monócitos ativados após a terapia TCZ não parecem ser a causa da remissão da doença, mas sim o efeito de TCZ. A percentagem de CD16 + CD14 + monócitos não clássicos tenderam a diminuir durante 52 semanas de tratamento com MTX em comparação com a de terapia TCZ. Este pode ter sido um resultado da melhoria da atividade da doença RA, ou pode algumas ações sobre as células imunes em comum entre TCZ e MTX.

conclusões

Nossos resultados sugerem que TCZ afetados proporções de T circulantes reg células, células B e monócitos em pacientes com AR. Especialmente, o aumento da proporção de T reg células entre células CD4 + células T bem correlacionados com a resposta clínica. Em seguida, o possível modo de acção do RA TCZ contra poderia aumentar a proporção de T reg células.

abreviaturas

ACPA: 

anticorpo proteína Anticitrullinated

 

ACR: 

American College of Rheumatology

 

CCP: 

peptídeos cíclicos citrulinados

CDAI: 

Clínica Índice de Atividade da Doença

 

PCR: 

proteína C-reativa

csDMARD: 

medicamento anti-reumático modificador da doença sintética convencional

D-VAS: 

escala visual analógica do médico

 

ESR: 

Taxa de sedimentação de eritrócitos

EULAR: 

Liga Europeia contra o Reumatismo

 

HAQ-DI: 

Avaliação de Saúde Disability Index Questionário

HDA: 

alta atividade da doença

 

IL-6R: 

receptor de interleucina-6

 

IQR: 

intervalo interquartil

LDA: 

baixa atividade da doença

 

mAb: 

O anticorpo monoclonal

 

MDA: 

atividade da doença moderada

MMP-3: 

Metaloproteinase de matriz-3

 

MTX: 

metotrexato

 

PBMC: 

células mononucleares do sangue periférico

Pt-VAS: 

escala visual analógica do paciente

 

RA: 

Artrite reumatóide

 

RF: 

Fator reumatóide

SDAI: 

Simplificado Índice de Atividade da Doença

 

SJC: 

contagem de articulações inchadas

 

TCZ: 

tocilizumab

TJC: 

contagem de articulações Tender

 

TNF: 

Fator de necrose tumoral

 

Treg: 

células T reguladoras

declarações

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Chugai Pharmaceutical Co, Ltd.

arquivo adicional

Arquivo adicional 1: Tabela S1. Subconjuntos identificados de células mononucleares do sangue periférico definidos usando marcadores da superfície celular. Tabela S2. Correlações entre subconjuntos periféricos de células T e marcadores séricos, medidas compostas de atividade da doença, e pontuação de Avaliação Health Questionnaire Disability Index no início do estudo. Coeficiente de correlação de Spearman foi utilizado para análise. Tabela S3. Correlações entre subpopulações de células B periféricas, natural killer (NK) e subgrupos de monócitos e marcadores sorológicos, medidas compostas de atividade da doença, e pontuação de Avaliação Health Questionnaire Disability Index no início do estudo. Coeficiente de correlação de Spearman foi utilizado para análise. Tabela S4. Demografia da linha de base e características clínicas dos pacientes tratados com MTX. Tabela S5. Alterações em proporções (%) de subconjuntos e marcadores de superfície de células B e monócitos durante o tratamento MTX. Subconjuntos e marcadores de superfície foram selecionados como os mais alterados em terapia TCZ. Figura S1. Estratégia Gating para citometria de fluxo análise do T reg células e subconjuntos de monócitos. Figura S2. Alterações cronológica e proporções de atividade clínica da linha de base até a semana 52 de TCZ tratamento. Figura S3. mudanças Cronológico em atividade clínica da linha de base até a semana 52 do tratamento MTX. Figura S4. as relações entre os efeitos de MTX sobre a proporção de Treg células e respostas clínicas. (a) a mudança cronológica na proporção de T reg células entre CD4 + células T desde o início até a semana 52 do tratamento MTX. (B) as relações entre a mudança na atividade clínica (pontuações ΔCDAI e ΔSDAI) ea mudança na proporção de T regcélulas entre as células T CD4 + (AT reg / CD4) na semana 52. Os quadrados significam medianas e intervalos interquartis.

Interesses competitivos

JK, KY, NN e YK declarar que eles não têm interesse competindo. MH é um funcionário da Chugai Pharmaceutical Co, Ltd. TT recebeu subsídios da Astellas Pharma Inc, Bristol-Myers KK, Chugai Pharmaceutical Co, Ltd, a Daiichi Sankyo Co, Ltd, a Eisai Co, Ltd, Mitsubishi Tanabe Pharma Corp, Pfizer Japão, Santen Pharmaceutical Co, Ltd, Takeda Pharmaceutical Co, Ltd, Teijin Pharma Ltd, Abbvie GK, Asahi Kasei Pharma Corp, Taisho Pharmaceutical Toyama Co, Ltd, e SYMBIO Pharmaceuticals Ltd; taxas falando de Abbvie GK, Bristol-Myers KK, Chugai Pharmaceutical Co, Ltd, a Eisai Co, Ltd, Janssen Pharmaceutical KK, Mitsubishi Tanabe Pharma Corp, Pfizer Japão Inc, Takeda Pharmaceutical Co, Ltd, Astellas Pharma Inc, e Daiichi Sankyo Co, Ltd; e honorários de consultores de Astra Zeneca KK, Eli Lilly Japan KK, Novartis Pharma KK, Mitsubishi Tanabe Pharma Corp, Asahi Kasei Medical Co, Ltd, Abbvie GK, a Daiichi Sankyo Co, Ltd, e Bristol-Myers KK.

Contribuições dos autores

JK realizada citometria de fluxo, participou no desenho do estudo, analisou os dados, realizada a análise estatística, avaliou os resultados e elaborou o manuscrito. MH realizada citometria de fluxo, participou no desenho do estudo, analisou os dados, avaliou os resultados e elaborou o manuscrito. YK participou no desenho do estudo, avaliou os resultados e ajudou a redigir o manuscrito. KY participou de citometria de fluxo, avaliou os resultados e ajudou a redigir o manuscrito. NN analisados ​​os dados, avaliou os resultados e ajudou a redigir o manuscrito. TT concebeu o estudo, participou de sua elaboração e coordenação, avaliou os resultados e ajudou a redigir o manuscrito.Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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