TRABALHO CIENTIFICO COMPLETO =A CURCUMINA RETARDA A PROGRESSÃO DA OSTEOARTRITE E ALIVIA OS SINTOMAS DA DOR ASSOCIADA À OSTEOARTRITE EM UM MODELO PÓS TRAUMÁTICO RATO OSTEOARTRITICO

A curcumina retarda a progressão da osteoartrite e alivia os sintomas da dor associada à osteoartrite em um modelo pós-traumático rato osteoartrite

• Zhuo Zhang † ,
• Daniel J. Leong † ,
• Lin Xu ,
• Zhiyong Ele ,
• Angela Wang ,
• Mahantesh Navati ,
• Sun J. Kim ,
• David M. Hirsh ,
• John A. Hardin ,
• Neil J. Cobelli ,
• Joel M. Friedman e
• Hui B. Sunemail autor

† contribuíram igualmente

Arthritis Research & Therapy201618 : 128

DOI: 10,1186 / s13075-016-1025-Y

© O autor (s). 2016

Recebido: 04 de fevereiro de 2016

Aceito: 18 de maio de 2016

Publicação: 03 de junho de 2016

Abstrato

fundo

A curcumina foi mostrado para ter potencial condroprotectores in vitro. No entanto, o seu efeito sobre a doença e modificação dos sintomas em osteoartrite (OA) é em grande parte desconhecida. Este estudo teve como objetivo determinar se a curcumina poderia retardar a progressão da OA e aliviar a dor relacionada à OA em um rato modelo de desestabilização do menisco medial (DMM).

Métodos

Expressão de genes associados a degradação de cartilagem, foram avaliadas em condrócitos primários humanos tratados com curcumina e curcumina nanopartículas e ensaiaram-se por PCR em tempo real. Os ratos submetidos a cirurgia DMM foram administrados oralmente a curcumina ou topicamente administrada nanopartículas curcumina durante 8 semanas. integridade da cartilagem foi avaliada por coloração com safranina O e pontuação osteoartrite Research Society International (OARSI), e por coloração imuno-histoquímica de colagénio clivado agrecano e tipo II, e os níveis de metaloproteinase de matriz (MMP) e -13 ADAMTS5. Sinovite e espessura do osso subcondral foram marcados com base em imagens histológicas. dor OA-associados e os sintomas foram avaliados pelo ensaio de von Frey, e comportamento locomotor incluindo distância percorrida e criação.

Resultados

Ambos curcumina e nanopartículas encapsular curcumina suprimiu a expressão de ARNm de mediadores pró-inflamatórias de IL-1p e TNF-a, as MMPs 1, 3, e 13, e agrecanase ADAMTS5, e regulada positivamente o regulador transcricional condroprotectores CITED2, em condrócitos de cultura principal, na ausência ou presença de IL-1β. A administração oral de curcumina reduziu significativamente a progressão da doença OA, mas não mostrou efeito significativo no alívio da dor OA. A curcumina foi detectado na almofada de gordura infrapatellar (IPFP) a seguir à administração tópica de nanopartículas curcumina na pele do joelho lesionado do rato. Em comparação com os controlos tratados com veículo, o tratamento tópico conduziu a: (1) redução da perda de proteoglicano e de erosão da cartilagem e pontuações OARSI inferior, (2) redução da sinovite e da espessura da placa subcondral, (3) reduzida coloração imunoquímico de colagénio tipo II e epitopos de clivagem de agrecano e número de condrócitos positivos para a MMP-13 e ADAMTS5 na cartilagem articular, e (4) expressão reduzida de adipocitoquinas e mediadores pró-inflamatórios em IPFP. Em contraste com a curcumina oral, aplicação tópica de nanopartículas curcumina aliviou a dor OA-relacionada, tal como indicado pela redução da hipersensibilidade táctil e melhorou o comportamento locomotor.

Conclusão

Este estudo fornece a primeira evidência de que a curcumina retarda significativamente a progressão da doença OA e exerce um efeito paliativo em um modelo de rato OA.

Palavras-chave

Pós-traumático osteoartrite curcumina Nutracêuticos Condroprotecção MMPs ADAMTS5

fundo

A osteoartrite (OA) é uma doença progressiva e degenerativa das articulações articulares envolvem a cartilagem articular, membrana sinovial, e do osso subcondral, e é uma causa principal da dor e da deficiência na população adulta [ 1 ]. Apesar da elevada prevalência da OA, não existe actualmente nenhuma cura ou tratamento eficaz que pára ou inverte a progressão da doença [ 2 ]. Enquanto tratamentos farmacológicos atuais, como analgésicos e anti-inflamatórios não-esteróides (AINEs) proporcionar alívio sintomático, como alívio da dor, eles não exercem um efeito clínico clara sobre OA prevenção ou modificação doença [ 3 ]. Na maioria dos casos, o uso a longo prazo destes tratamentos tem sido associada com substancial gastrointestinal, renal e efeitos secundários cardiovasculares [ 3 ]. Há uma necessidade clara e urgente de novas estratégias terapêuticas que são eficazes e seguros para o tratamento OA.

A curcumina, o principal curcuminoid eo componente mais ativo no açafrão, é um fitoquímico biologicamente ativa [ 4 , 5 ]. Evidências de vários estudos in vitro recentes sugere que a curcumina pode exercer um efeito condroprotetor através de ações como, estresse oxidativo anti-anti-inflamatória, e atividade anti-catabólico que são críticos para mitigar OA patogenia e sintomas da doença. Por exemplo, a curcumina foi mostrado para atenuar o processo inflamatório, diminuindo a síntese de mediadores inflamatórios, tais como a interleucina (IL) -1β, factor de necrose tumoral (TNF) -a, IL-6, IL-8, prostaglandina E2 (PGE 2 ) , e ciclo-oxigenase-2 (COX-2) [ 6 , 7 , 8 ], inibir a degradação da matriz extracelular induzida por IL-1β [ 9 ] e condrócitos apoptose [10 , 11 ], e reduzir o excesso de produção de oxigénio reactivo e de azoto espécies [ 12 , 13 ]. Além disso, a curcumina, inibindo a (AP-1) via da proteína activador 1 [ 14 ] e do factor nuclear kappa B (NF-kB) activação [14 , 15 , 16 ], suprime a expressão do gene de uma série de metaloproteinases da matriz (MMPs ), que desempenham papéis críticos na degradação da matriz extracelular da cartilagem [ 7 , 14 , 15 , 16 , 17 ].

Apesar do progresso recente, o efeito da curcumina na progressão da doença OA e alívio da dor é em grande parte desconhecido. Moon et al. mostraram que, após injecção intraperitoneal de curcumina em dias alternados durante 2 semanas, a expressão do TNF-α e IL-1β na articulação do tornozelo, e as concentrações de imunoglobulina no soro em ratos com artrite induzida por colagénio foram regulados negativamente em comparação com ratinhos não tratados com curcumina [ 18 ], sugerindo a curcumina pode ser benéfico em artrite reumatóide. Além disso, Colitti et ai. descobriram que a administração oral de curcumina em caninos com OA espontânea leva à diminuição da IL-18 e TNF-α produção, e a inibição do factor de transcrição NF-inflamatória kB em células brancas do sangue [ 19 ]. O estudo sugere que um efeito anti-inflamatória potencial de curcumina sobre as articulações em OA.

Embora vários estudos sugerem que a administração oral de curcumina pode exercer um efeito no alívio da dor relacionada com a OA [ 20 , 21 , 22 , 23 , 24 ], a aplicação tópica pode proporcionar outro método de tratamento ideal para paciente. Mais importante, ele pode aumentar a biodisponibilidade da curcumina no local da doença para o tratamento de OA. Neste estudo, pretendemos determinar as eficácias de curcumina por entrega oral e nanopartículas feitas sob medida através da administração tópica na OA doenças e sintomas modificação usando um mouse modelo de OA pós-traumático.

Métodos

Cultura celular e tratamento in vitro curcumina

Todos os estudos em humanos foram aprovadas pelo Albert Einstein College of Medicine Institutional Review Board. Condrócitos primários humanos derivados de pacientes submetidos a cirurgia de substituição da articulação (com idades entre 58-69 anos, as mulheres, n = 3) foram cultivadas em DMEM / F12 com soro de bovino fetal a 10% [ 25 ]. Antes do tratamento, a curcumina, as células foram cultivadas em DMEM / F12 com soro fetal bovino a 1% durante a noite. Em algumas experiências, os condrócitos foram incubados com IL-1 (10 ng / ml, Sigma) 30 minutos antes da incubação com a curcumina (100 uM, Sigma) ou curcumina (100 uM) encapsulados dentro de nanopartículas durante 6 horas. As células foram em seguida lisadas e o RNA isolado para a reacção de transcrição reversa quantitativa de polimerase em cadeia (real-time PCR) [ 26 ]. A dose (100 uM) e a duração do tratamento (6 horas) foram escolhidos com base em ensaios de dose-resposta (0-200? M) e o curso do tempo (0-48 horas) de condrócitos primários humanos tratados com curcumina não encapsulado (arquivo adicional 1 : Figura S1).

Preparação de nanopartículas de curcumina

Nanopartículas curcumina foram preparadas utilizando uma variação de uma plataforma de nanopartículas que foi desenvolvido para fornecimento tópico e sistémico de óxido nítrico [ 27 , 28 , 29 ] em três passos como se segue [ 30 ]: (1) hidrólise de tetra-metil-ortossilicato (TMOS ). Hidrolisado de TMOS é preparada por sonicação à temperatura do gelo, uma mistura de 3 ml de TMOS e ul HCl 600 mM 1 numa pequena garrafa de vidro com rolha de borracha. Após a ultra-sons a solução bifásica inicial transforma-se em uma solução monofásica. A solução monofásica é armazenado a 4 ° C durante uma hora para ajudar a eliminar o metanol, um subproduto da hidrólise de TMOS (metanol residual é posteriormente eliminado durante o processo de liofilização); (2) polimerização. Os seguintes ingredientes são adicionados sequencialmente, para um tubo cónico de 50 ml, que é invertida (para facilitar a mistura) depois de cada adição de um ingrediente: 24 ml de PBS 50 mM pH 7,5, 1,5 ml de PEG 400, 1,5 ml de quitosano (5 mg / ml) a pH 6 com ácido acético, 4 mL de 5 mg / ml de curcumina (Sigma) dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) e, finalmente, 3 ml de TMOS hidrolisado. Depois de todos os ingredientes são misturados um gel homogéneo é formado em cerca de 30 minutos; (3) liofilização e bola de moagem. O sol-gel húmido contendo a curcumina é durante a noite liofilizada. O pó seco é claro resultante é, em seguida, e armazenado num frasco selado durante a utilização subsequente para as experiências branqueado-esfera. Uma versão muito semelhante desta plataforma tem sido usado para o tratamento de infecções tópicas e acelerar a cicatrização de feridas [ 31 ].

Indução de osteoartrite em ratinhos e tratamento curcumina

Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care e do Comitê Use. A desestabilização do menisco medial (DMM) foi criada em ratinhos adultos C57BL / 6 macho (macho, 5-6 meses de idade), ao seccionar o ligamento cirurgicamente meniscotibial medial (MMTL) no membro posterior direito [ 32 ]. Em resumo, a cápsula articular medial imediatamente ao tendão patelar foi incisada, seguido por dissecção romba da gordura infrapatelar, para proporcionar a visualização do MMTL do menisco medial. O MMTL foi seccionado, levando à desestabilização do menisco medial (DMM). Na cirurgia sham, o MMTL foi visualizado mas não seccionado. A cápsula ea pele conjunta foram fechadas por sutura.Imediatamente após a cirurgia DMM, os ratinhos foram submetidos a (1) a administração oral de 50 mg / kg de curcumina (Sigma) dissolvida em óleo de milho ou o veículo (óleo de milho apenas) administrado através de sonda oral (n = 8 / grupo), ou (2 ) aplicação tópica de nanopartículas curcumina (0,07 mg de 10? g a curcumina / 1 mg nanopartículas) ou controlo de veículo (óleo de coco) sobre a pele, a cerca de 5 mm 2 área directamente acima do joelho DMM-operados (n = 5 / grupo) , uma vez por dia durante 8 semanas.

Safranina O coloração, pontuação OARSI e avaliação histológica da sinóvia e osso subcondral

Os animais foram sacrificados às 8 semanas a seguir ao tratamento curcumina. Os membros posteriores foram fixos em formalina, descalcificados em ácido fórmico, embebidos em parafina, seccionados e para análise histológica e análise imuno-histoquímica. coloração verde afranin O-rápido foi usada para visualizar os proteoglicanos na cartilagem articular. A gravidade da OA foi avaliada no compartimento medial do joelho, com pelo menos cinco secções para cada rato utilizando o sistema de osteoartrite Research Society International (OARSI) pontuação [ 33 ]. A patologia sinovial (ou seja, sinovite) foi analisada em cortes corados safranina O a partir do qual foram obtidos os escores OARSI. O grau de sinovite foi marcado utilizando um sistema de pontuação que medida a espessura da camada de revestimento sinovial célula numa escala de 0-3 (0 = 1-2 células, 1 = 2-4 células, 2 = 4-9 células e três = 10 ou mais células) e a densidade celular no estroma sinovial numa escala de 0-3 (0 = celularidade normal, 1 = ligeiro aumento da celularidade, 2 = moderadamente aumento da celularidade e 3 = muito maior celularidade). Sinovite pontuações obtidas a partir de todos os quatro quadrantes (tíbia medial, Fémur medial, lateral, da tíbia e do fémur laterais) para ambos os parâmetros acima referidos foram a média separadamente e, em seguida, foi usada a soma das médias a partir de ambos os parâmetros de análise (numa escala de 0- 6) [ 34 ]. A espessura da placa do osso subcondral medial (região entre a junção osteocondral e espaço medular na face medial do planalto tibial, em uM) foi medida usando o software AxioVision usando safranina O secções coradas a partir do qual foram obtidas as contagens OARSI e sinovite [ 35 ].

A análise imunohistoquímica

As secções foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos contra clivado agrecano (NITEGE, Bouquetin) e clivada do colagénio tipo II (Col2-3 / 4 H, Bouquetin), metaloproteinases de matriz (MMP) -13 (Abcam), e Proteína Adam com motivos de trombospondina (ADAMTS) 5 (Abcam) seguido de incubação com anti-rato ou um anticorpo secundário anti-coelho (Biocare Médico) e visualização com 3,3-diaminobenzidina (DAB) cromagénio (Vector Laboratories). Os controlos negativos foram coradas com anticorpos do mesmo isotipo irrelevante (Biocare Medical). Intensidade da imunocoloração por colagénio ou agrecano epitopos de clivagem do tipo II foi quantificada por determinação do "intensidade recíproco" da matriz da cartilagem articular corada; resumidamente, o valor da intensidade da luz de seis locais aleatórios dentro de todas as três zonas do posterior à direção anterior dos côndilos femorais e tibiais de três seções por rato foi medida usando o seletor de cores no Adobe Photoshop [ 36 , 37 ]. As percentagens de MMP-13 e ADAMTS5 condrócitos positivas foram determinadas pela contagem do número de células imunocoradas e dividindo-se pelo número total de condrócitos visualizadas por um contra-corante de hematoxilina (Vector Laboratories).

Na localização in vivo de curcumina aplicada topicamente

nanopartículas curcumina (0,07 mg de 10? g a curcumina / 1 mg nanopartículas dissolvidos em óleo de coco) ou controlo de veículo (óleo de coco) foram aplicados topicamente no joelho direito de adultos C57BL / 6 ratos (machos, 5-6 meses). Às 3, 6, e 24 horas depois do tratamento (n = 3 / grupo), os animais foram sacrificados e os membros posteriores foram fixos em formalina, descalcificadas em ido fmico, embebidos em parafina e seccionados para análise histológica. Seções (5 mm) foram coradas com hematoxilina e eosina (H & E), e fotografada por microscopia confocal para localizar as partículas curcumina dentro da articulação articular. Num grupo separado de animais, os ratinhos foram sacrificados 3 horas após a aplicação tópica de nanopartículas curcumina ou controlo de veículo (n = 3 / grupo). O IPFP do joelho direito foi dissecado e flash congelado. O ARN foi isolado por PCR em tempo real.

teste de von Frey

Os ratos foram aclimatados durante 30 minutos em câmaras individuais em cima de uma plataforma de rede de arame antes do teste de von Frey. A superfície plantar da pata traseira foi estimulado com ascendente intensidades de força de von Frey filamentos (Stoelting) para determinar a sensibilidade tátil. Uma resposta positiva foi definida como uma rápida retirada da pata traseira quando o estímulo foi aplicado, e o número de respostas positivas para cada estímulo foi gravado. Limiar táctil foi definida como uma resposta de retirada em 5 dos 10 ensaios para uma determinada intensidade de estímulo [ 37 ]. Este limite foi calculada uma vez por animal.

Dor e testes comportamentais relacionadas com a OA

Como nós e outros descrito anteriormente, os ratos foram aclimatados para a sala de ensaio durante 30 minutos antes do teste campo aberto [ 37 , 38 ]. Os ratos foram colocados no centro das câmaras quadrados Plexiglas individuais (45 cm x 45 cm) e deixou-se explorar livremente a câmara para a duração da sessão de teste de 6 minutos. Os movimentos dos ratinhos foram registadas com uma câmara de vídeo. Após a conclusão do teste, a qual foi realizada uma vez por animal, cada rato foi devolvido à sua gaiola de origem.Dois observadores cegos para trabalhos de grupo tratamento traçadas manualmente os movimentos do mouse para calcular a distância (em cm) que o rato viajou dentro da gaiola em 6 minutos (distância percorrida), e registrou o número de vezes que cada rato criados (de pé sobre as patas traseiras) dentro de 6 minutos (de crescimento) [ 38 ].

PCR em tempo real

O ARN total foi isolado com um kit RNeasy (Qiagen) e o ADNc foi sintetizado utilizando o kit de iScript Transcriptase Reversa (Bio-Rad). SYBR Green PCR em tempo real (Bio-Rad) foi realizada em duplicado para cada amostra para determinar a expressão do gene em relação usando desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato ( GAPDH ) como um controlo de arrumação com a 2 -ΔΔCt método de [ 26 , 37 ].

Analise estatistica

Os resultados são expressos como média ± DP. A significância foi determinada utilizando Student t teste ou análise de uma via de variância (ANOVA) e teste de comparação múltipla de Tukey com nível de significância de p  <0,05 (GraphPad).

Resultados

Gene mudança do perfil de expressão favorece Condroprotecção em condrócitos humanos tratados in vitro-curcumina

Nós primeira validado o potencial condroprotetor da curcumina pelo gene análise do perfil de expressão em condrócitos in vitro. Consistentes com estudos anteriores [ 7 , 14 , 15 , 16 , 17 ], condrócitos primários humanos, na ausência e presença de IL-1β, e tratados com curcumina, apresentaram níveis significativamente reduzidos de mRNA de enzimas proteolíticas de MMP-1, MMP-3 , e citoquinas pró-inflamatórias de MMP-13, e IL-1β e TNF-α ( p  <0,05) (Fig.  1 ). Curiosamente, tal como mostrado pela primeira vez, a curcumina reduziu significativamente a expressão de agrecanase ADAMTS5 e aumento da expressão de CITED2 (CBP / p300 Interacting transactivador com ED-rico cauda 2), MMP-reprimindo regulador transcricional ( p  <0,05) (Fig.  1 ) .Não foram observados efeitos de curcumina na expressão de genes anabólicos colagénio 2A1 e agrecano ( p  > 0,05) (Fig.  1 ).

FIG. 1

Os condrócitos tratados com curcumina exibe um perfil de expressão do gene que é favorável para Condroprotecção. Condrócitos primários humanos tratados com curcumina durante 6 horas apresentaram redução os níveis de mRNA de metaloproteinase de matriz ( MMP ) -1, MMP-3, MMP-13, uma desintegrina e metaloproteinase com motivos de trombospondina ( ADAMTS ) 5, IL-1β, TNF-α, e aumentou CITED2 em comparação com as células tratadas com o veículo, na ausência ( a ) e na presença ( b ) de IL-1β, enquanto que a expressão de colagénio 2A1 ( COL2A1 ) e agrecano ( Acan ) permaneceu inalterada. * P  <0,05, t de teste, n = 3 / grupo

A administração oral de curcumina retarda a progressão da doença, mas não afecta significativamente os sintomas relacionados com a OA em ratinhos com DMM

A seguir, determinou-se a eficácia da curcumina na OA-DMM induzida através da administração oral através da avaliação da integridade estrutural da cartilagem articular, utilizando microscopia seguinte safranina O coloração e avaliação OARSI. Oito semanas após a DMM, a cartilagem articular no membro com DMM nos ratinhos tratados com veículo exibiram alterações osteoartríticas patológicas moderadas caracterizadas por safranina O perda, fibrilação da cartilagem e erosão da cartilagem (Fig.  2a ), com uma pontuação OARSI de 4,0 ± 0,5 . (Fig.  2b ). Em contraste, a cartilagem no membro com DMM em ratinhos tratados com curcumina apresentaram uma menor perda de safranina O e fibrilhação de cartilagem (Fig.  2a ) com uma pontuação significativamente inferior OARSI (2,4 ± 0,42) comparada com a de controlos tratados com veículo ( p  < 0,05, Fig.  2b ). Curcumina tratamento também significativamente reduzida sinovite (Fig.  2c ) e a espessura da placa subcondral (Fig.  2d ) em comparação com os controlos de veículo ( p  <0,05 para ambos). No entanto, a administração oral de curcumina não teve nenhum efeito significativo sobre a mitigação da dor relacionada com a OA, tal como avaliadas pelo teste de von Frey, a distância percorrida e criação dos membros posteriores (não mostrados).

FIG. 2

A administração oral de curcumina diminuiu a progressão da osteoartrite pós-traumática em ratos. Ratos com desestabilização do menisco medial ( DMM ) foram tratados diariamente com a curcumina ( Cur ) ou veículo por meio de sonda oral. Ratos com DMM tratados com curcumina apresentaram melhora safranina O coloração ( um ), inferiores internacionais (osteoartrite Research Society OARSI contagens) ( b ), e sinovite reduzida ( c ) e a espessura da placa subcondral ( d ) em 8 semanas após a cirurgia, em comparação com os ratinhos com DMM, que foram tratados com veículo ( Veh ). * P  <0,05, t de teste, n = 8 / grupo. Imagens histológicos representativos são mostrados

nanopartículas curcumina exercer um efeito anti-catabólico e anti-inflamatória em condrócitos humanos in vitro

Enquanto que a administração oral de curcumina não-encapsulado exibiram significativa eficácia em retardar a progressão da OA, a sua eficácia terapêutica pode ser limitada pela sua biodisponibilidade oral relativamente pobre [ 39 ]. Assim, desenvolvemos nanopartículas curcumina utilizando um novo transportador polimérico nanopartículas [ 30 ]. Para testar se as nanopartículas encapsulam curcumina afectar o potencial condroprotectores de curcumina, comparou-se o perfil de expressão de genes em condrócitos humanos de cultura principal, na ausência ou presença de IL-1β e tratou-se com nanopartículas curcumina ou controlo de veículo. Nanopartículas curcumina reduziu significativamente os níveis de ARNm de MMP-1, MMP-3, MMP-13, ADAMTS5, IL-1β e TNF-α, e aumento dos níveis de condrócitos CITED2 em comparação com o controlo de veículo ( p  <0,05 para todos), numa nível comparável ao de condrócitos tratados com curcumina não encapsulados, com base na concentração equivalente de curcumina, na ausência ou presença de IL-1β ( p  > 0,05 para todos, Fig.  3 ). Não foram observados efeitos significativos de nanopartículas curcumina na expressão de colagénio 2A1 e agrecano ( p  > 0,05) (Fig.  3 ).

FIG. 3

Nanopartículas curcumina exercer efeito anti-catabólico e anti-inflamatório sobre a expressão do gene de condrócitos primários humanos na ausência de IL-1β ( um ) e a presença de IL-1β ( b ). Condrócitos primários humanos tratados com encapsulado em nano curcumina (nano-curcumina) durante 6 horas apresentaram redução os níveis de mRNA de metaloproteinase de matriz ( MMP ) -1, MMP-3, MMP-13, uma desintegrina e metaloproteinase com motivos de trombospondina ( ADAMTS5 ), IL -1β, TNF-α, e aumento dos níveis de CITED2 comparada com a de células tratadas com o veículo, enquanto que a expressão de colagénio 2A1 ( COL2A1 ) e agrecano ( Acan ) permaneceu inalterada. * P  <0,05, t de teste, n = 5 / grupo

nanopartículas curcumina tópicas localizar e são eficazes na gordura infrapatelar (IPFP)

Para testar se a aplicação local, tópica de nanopartículas curcumina exerceriam maior eficácia no tratamento de OA, foram determinados em primeiro lugar se nanopartículas curcumina pode penetrar nos tecidos das articulações após a aplicação tópica para o joelho do rato. A curcumina foi detectado no IPFP às 3 horas após a aplicação tópica, como mostrado na Fig.  4a , mas não foi detectada na cartilagem articular ou outros tecidos articulares, ou 6 ou 24 horas após a aplicação tópica (não mostrado), utilizando microscopia confocal baseado sobre a auto-fluorescência de curcumina [ 40 ]. Como curcumina foi localizada dentro do IPFP, nós próxima examinado o efeito do tratamento tópico curcumina nanopartículas sobre o perfil de mediadores pró-inflamatórios em IPFP, que foram mostrados para ter um impacto significativo sobre a homeostase da cartilagem e a OA [a expressão do gene 41 , 42 , 43 ]. Conforme revelado por PCR em tempo real, o tratamento suprimida a expressão de ARNm de adipocitoquinas adipsina , leptina , adiponectina , transcrição Adipo-regulação factores de ligação a proteína alfa (CCAAT / enhancer CEBPA ) e peroxissoma do receptor gama activado por proliferador ( PPARg ), e MMP13 e Adamts5 ( P  <0,05 para todas, a Fig.  4b ).

FIG. 4

A aplicação tópica de nanopartículas curcumina no joelho mouse é localizada na gordura infrapatelar e suprime adipocina e expressão de genes relacionados com a adipogênese. Coloração H & E e microscopia confocal da gordura infrapatelar das articulações do joelho rato tratados com tópica curcumina encapsulado em nano ( Nano-C). Imagens histológicos representativos são mostrados ( um ). Expressão de mRNA relativo de adipocinas, reguladores de transcrição relacionados com a adipogênese, metaloproteinases de matriz ( MMP - 13 ), e Proteína Adam com motivos trombospondina ( ADAMTS5 ) na gordura infrapatelar de curcumina nanopartículas-ratinhos tratados vs comandos do veículo ( b .) Adp A adiponectina, PPARg receptor gama activado pelo proliferador de peroxissoma-, CEBPA alfa proteína de ligação CCAAT / enhancer, Veh veículo. * P  <0,05, t de teste, n  =  3 / grupo .Barra de escala  = 50 uM

A aplicação tópica de nanopartículas curcumina retarda a progressão da OA em ratos com DMM

Para determinar a eficácia da aplicação tópica de nanopartículas curcumina na progressão da doença OA, avaliou-se a integridade estrutural da cartilagem articular, após oito semanas de tratamento curcumina tópica diária, começando imediatamente a seguir DMM em ratinhos. Oito semanas após a DMM, a cartilagem articular no membro com DMM nos ratinhos tratados com veículo exibiram alterações osteoartrítica patológica moderada caracterizada por safranina O perda e cartilagens atrial (Fig.  5a ), e uma pontuação média OARSI de 5,8 ± 2,1 (Fig.  5b ). Em contraste, a cartilagem no membro com DMM em ratinhos tratados com nanopartículas curcumina apresentaram uma menor perda de safranina O e cartilagem atrial (Fig.  5a ), e a pontuação OARSI significativo (1,8 ± 0,35) foi significativamente inferior em comparação com os controlos tratados com veículo ( p  <0,05, fig.  5b ). Em adição, nanopartículas curcumina reduziu significativamente sinovite (Fig.  5c ) e a espessura da placa subcondral (Fig.  5d ) em comparação com controlos tratados com veículo ( p  <0,05 para ambos).

FIG. 5

A aplicação tópica de curcumina encapsulado em nano retardou a progressão da OA induzida pela desestabilização do menisco medial ( DMM ) em ratinhos. Ratos com DMM foram tratados diariamente com a aplicação tópica de nanopartículas curcumina ou veículo. Ratos tratados topicamente com nanopartículas de curcumina ( Nano-C ) apresentaram melhora safranina O de coloração ( uma ), mais baixos Osteoarthritis Research Society International (OARSI ) marca ( b ), e sinovite reduzida ( c ), e espessura da placa de osso subcondral ( d ) a 8 semanas após a cirurgia em que em comparação com o controlo de veículo ( Veh ) (* P  <0,05, t de teste, n = 5 / grupo). Imagens histológicos representativos são mostrados

A aplicação tópica de nanopartículas curcumina reduziu marcadores degradação da matriz e níveis de MMP-13 e ADAMTS5 na cartilagem de camundongos com DMM

Coloração imuno-histoquímica mostrou que o tratamento tópico curcumina reduziu fortemente os níveis do colagénio epitopo de clivagem de tipo II (Col2 3/4 H) em ratinhos com DMM em comparação com ratinhos tratados com veículo com DMM (Fig.  6a ). Com base nas intensidades de imunocoloração das seis zonas escolhidas ao acaso da cartilagem articular em 8 semanas seguintes DMM, tipo de clivagem de colagénio II foi reduzida para 0,58 vezes maior em animais tratados com curcumina comparação com os controlos tratados com veículo ( p  <0,05, a Fig.  6a ) . Coloração imuno-histoquímica mostrou que o tratamento semelhante de nanopartículas curcumina reduziu os níveis de clivada agrecano (NITEGE) em ratinhos com DMM em comparação com ratinhos tratados com veículo com DMM às 8 semanas (Fig.  6b ). Às 8 semanas após a DMM, a intensidade da imunocoloração de agrecano clivado nos ratinhos tratados com nanopartículas curcumina com DMM foi reduzida para 0,68 vezes quando comparada com os ratinhos tratados com veículo (p  <0,05, fig.  6b ).

FIG. 6

A aplicação tópica de nanopartículas curcumina reduzida a degradação da matriz da cartilagem articular e reduziu a expressão de metaloproteinase de matriz-13 ( MMP-13 ) e Proteína Adam com motivos trombospondina-5 (ADAMTS5 ). A intensidade de coloração imuno-histoquímica de tipo II epitopo de clivagem de colagénio ( Col2-3 / 4 M ) ( um ) e clivado agrecano ( NITEGE ) ( b ), e a percentagem de células positivas de coloração imuno-histoquímica de MMP-13 ( C ), e de ADAMTS5 ( d ) na cartilagem articular de ratinhos com desestabilização do menisco medial (DMM ) que foram tratados com nanopartículas curcumina ( NC ) durante 8 semanas após a cirurgia foram significativamente reduzidas em comparação com ratinhos com DMM tratado com veículo ( Veh ) (* P  < 0,05, t de teste, n = 5 / grupo). A barra de escala  = 100 uM. Imagens de imuno-histoquímica representativos são mostrados

Degradação da matriz da cartilagem é mediada principalmente por duas grandes famílias de enzimas proteolíticas, nomeadamente MMPs e ADAMTS [ 44 ]. Em particular, a MMP-13 é a enzima mais potente na clivagem do colagénio tipo II, a forma principal na cartilagem articular, enquanto ADAMTS5 foi mostrado em ratinhos para clivar agrecano, os principais proteoglicano da cartilagem [ 2 ]. Estudámos, portanto, se a redução da MMP-13 e ADAMTS5 podem estar subjacentes ao efeito condroprotetor da curcumina utilizando análise imunohistoquímica.

Às 8 semanas seguintes DMM, a percentagem de células de MMP-13-positivas na cartilagem articular foi reduzida de 63% em ratinhos tratados com veículo a 16% em ratinhos tratados com curcumina ( p  <0,05, a Fig.  6c ). Da mesma forma, a curcumina reduziu a percentagem de células ADAMTS5-positivo de 68% em ratos tratados com o veículo de 37% ( p  <0,05, a Fig.  6d ). Estes dados sugerem que o tratamento curcumina melhora a integridade da cartilagem articular, preservando componentes tanto colagénio e agrecano em ratinhos com OA pós-traumático, e que os efeitos condroprotetor exercidas por curcumina são mediados, pelo menos em parte, através da supressão da colagenase predominante MMP -13 e predominante ADAMTS5 agrecanase.

nanopartículas curcumina tópicas reduzir a dor relacionadas com a OA

A progressão da OA é acompanhada de sintomas clínicos secundários, o mais proeminente da dor [ 45 , 46 ].Às 8 semanas seguintes reduções DMM, os ratos tratados com o veículo exposto no limiar de resposta aos estímulos mecânicos ( p  <0,05, teste de von Frey, Fig.  7a ), distância percorrida (Fig.  7b ), e de criação (em pé sobre membros posteriores, Fig.  7c ), em comparação com controlos sem tratamento prévio ( p  <0,05).Animais tratados topicamente com nanopartículas curcumina apresentaram redução da hipersensibilidade táctil ( p  > 0,05, Fig.  7a ), e o aumento da distância percorrida ( p  > 0,05, Fig.  7b ) e de criação ( p  > 0,05, Fig. 7c ).

FIG. 7

A aplicação tópica de nanopartículas curcumina reduz sintomas de dor relacionadas com a osteoartrite.Sensibilidade táctil (teste de von Frey) ( um ), e a distância percorrida ( b ) e número de vezes criados ( c ) por 6 minutos num campo aberto, em ratinhos com desestabilização do menisco medial ( DMM ) tratado com nanopartículas curcumina ( Nano -C ) em 8 semanas após a cirurgia DMM, não diferiram dos controles naïve (# p  > 0,05, one-way análise de variância (ANOVA) com o teste post-hoc de Tukey, n = 5 / grupo), mas havia uma melhoria significativa em comparação a ratinhos com DMM tratados com veículo ( Veh ) (* P  <0,05, ANOVA de uma via com o teste post-hoc de Tukey, n = 5 / grupo)

Discussão

Neste estudo demonstrámos a primeira evidência in vivo para mostrar que a administração oral e tópica curcumina retarda a progressão da OA pós-traumático no modelo de ratinho de DMM. Especificamente, mostraram que a administração oral ou tópica de curcumina imediatamente após DMM retardou significativamente retardada ou a iniciação e a progressão da OA em ratinhos. Isto foi indicado pelo menor erosão da cartilagem e perda de proteoglicanos, sinovite reduzida e espessura da placa subcondral, redução da degradação de colágeno tipo II e agrecano e menor expressão de MMP-13 e ADAMTS5 após o tratamento curcumina em comparação com controlos de veículo. O potencial terapêutico e preventivo da curcumina é extremamente valioso, dado cerca de 50% dos pacientes que sofrem lesões articulares, tais como lágrimas do ligamento cruzado anterior, desenvolver OA dentro de 10-15 anos [ 47 ], e que não existe uma terapia modificadora da doença para OA [ 48 ].

Além disso, nós fornecemos a primeira evidência de um efeito paliativo da curcumina encapsulados em nanopartículas feitas sob medida aplicados topicamente para uma junta de osteoartrite em camundongos.Ratos com DMM tratado com nanopartículas curcumina exibiram uma diminuição da sensibilidade a estímulos mecânicos e aumentou o comportamento locomotor (isto é, a distância percorrida e elevação) em comparação com ratinhos tratados com veículo, sugerindo uma melhoria de dor relacionada com a OA. Os resultados são consistentes com um, duplo-cego, controlado por placebo recentemente randomizados, em que os pacientes com OA receber um curcuminoid tiveram escores significativamente mais baixos no Ontário Ocidental e McMaster Universities Índice de osteoartrite (WOMAC) e índice funcional dor de Lequesne do que os pacientes que receberam um placebo [ 23 ].

Atualmente, não há cura para a OA ou um agente terapêutico com a evidência comprovada para retardar ou parar a progressão da OA [ 49 ]. Tratamentos utilizados para aliviar temporariamente a dor na OA, como AINEs, também podem causar gastrointestinal grave, renal, e efeitos colaterais cardiovasculares após o uso a longo prazo [ 49 , 50 , 51 ]. Além disso, os pacientes experimentam alívio da dor sem uma melhoria simultânea na própria doença pode se tornar menos consciente sobre como proteger suas articulações doentes (tais como, evitando o uso excessivo), e pode inadvertidamente exacerbar a progressão da OA. Por outro lado, uma droga OA que pára a progressão da OA mas não aliviar OA-relacionadas dor pode não ser eficaz, como a adesão do paciente seria provavelmente baixo. Após a validação adicional em outros modelos animais e ensaios clínicos, os efeitos da curcumina em ambas as doenças e sintomas modificação torná-lo um potencial agente terapêutico atraente para OA.

Embora a etiologia e mecanismos patogênicos tanto para a iniciação ea progressão da OA não são claras, respostas inflamatórias, sobre-activada atividade catabólico e estresse oxidativo são considerados comuns em ambos os processos [ 2 , 44 , 52 , 53 ]. Os efeitos da curcumina na inflamação atenuante, de formação de espécies de oxigénio reactivas, e a actividade catabólica têm sido sugeridos em condrócitos in vitro, [ 7 , 14 ,15 , 16 , 18 , 19 ], em fibroblastos sinoviais humanos, e em artrite induzida por colagénio no rato modelos [ 7 ,14 , 15 , 16 , 18 , 19 ]. Além disso, Colitti et ai demonstraram um efeito anti-inflamatório da curcumina na expressão de genes de células brancas do sangue periférico em cães com OA [ 16 ]. Consistente com estes estudos, demonstrou-se que a curcumina, em ambos os não-encapsulada (Fig.  1 ) e formas encapsuladas (Fig.  3 ) exerce grandes efeitos condroprotetor em condrócitos primários humanos por suprimir a expressão dos genes que codificam citoquinas inflamatórias IL-1β e TNF-α, e enzimas de degradação de cartilagem da família MMP, incluindo MMP-1, MMP-3 e MMP-13. Também demonstramos pela primeira vez que a curcumina suprime a expressão de agrecanase ADAMTS5, uma proteinase chave na destruição da cartilagem durante a OA que cliva primariamente os componentes de agrecano da matriz extracelular da cartilagem [ 54, 55 , 56 ]. A curcumina também induz a expressão gênica de CITED2, um regulador transcricional MMP-repressão. Nós anteriormente demonstrado que CITED2, em resposta a carga mecânica moderada, reprime a expressão de MMP-1 e MMP-13 in vitro [ 57 ] e in vivo [ 26 ]. NF-kB é um factor chave que desencadeia a expressão de vários genes implicados na destruição da cartilagem, inflamação da membrana sinovial, e a reabsorção óssea [ ​​58 , 59 ]. Como CITED2 pode regular negativamente a actividade de NF-kB em células de rim embrionário [ 60 ], a curcumina pode exercer seus efeitos condroprotetor suprimindo a atividade de NF-kB por upregulating CITED2.

Tem sido relatado que a curcumina é pouco solúvel na água e fraca absorção é alcançada a partir das células epiteliais no tracto gastrointestinal. Ratos que receberam uma dose oral de 75% a curcumina excretado nas fezes inalteradas, com menos do que 0,02% recuperado a partir do fígado, rim, e gordura corporal [ 61 ]. No entanto, vários estudos que analisem os níveis plasmáticos de curcumina ou os seus metabolitos foram detectados curcumina, embora apenas pequenas quantidades seguintes, doses relativamente elevadas de administração oral em seres humanos [ 62 , 63 ]. Neste estudo, foi demonstrado que a administração oral de curcumina exercida eficácia em retardar a progressão da OA pós-traumática. No entanto, um efeito paliativo não foi observada em ratinhos com OA induzidas pelo DMM quando administrado por via oral a curcumina foi neste estudo. Os dados sugerem oralmente entregue curcumina é improvável que atingir concentrações biologicamente / farmacologicamente activas no soro, fluido sinovial, ou os tecidos das articulações, que são suficientes para atenuar a dor relacionada com a OA [ 4 ]. Juntos, a nossa observação indica ainda que o alívio da dor e seus sintomas podem exigir maiores níveis de curcumina em comparação com os exigidos para a modificação doença.

Como a administração tópica é um método de administração de fármaco ideal para o tratamento do paciente em OA, foi examinada a eficácia da administração tópica de nanopartículas encapsulam curcumina na OA modificação da doença e a melhoria dos sintomas em ratinhos com OA induzidas pelo DMM. A aplicação tópica de nanopartículas curcumina foi eficaz não apenas na alteração da doença OA (Fig.  5 ), mas também no alívio de dores relacionadas com a OA (Fig.  7 ). Os dados indicam que a aplicação tópica de curcumina encapsulado dentro de nanopartículas preserva a actividade condroprotectores de curcumina, e pode aumentar a sua biodisponibilidade.

As alterações patológicas em OA induzida pelo DMM, incluindo a destruição da cartilagem, sinovite e espessamento do osso subcondral, são observadas em OA humana [ 32 ]. O nosso estudo mostra que o tratamento curcumina via oral (fig.  2 ) ou tópica (Fig.  5 ) melhoraram significativamente as alterações patológicas relacionadas com OA na membrana sinovial e o osso subcondral, indicando que a curcumina tem potencial global para o tratamento de tecidos articulares, na OA [ 2 ].

O IPFP é um tecido adiposo localizado dentro da cápsula sinovial da articulação do joelho, o que pode contribuir para o baixo grau de inflamação e de degeneração de cartilagem através da secreção de adipocitoquinas e mediadores pró-inflamatórios na articulação sinovial [ 64 , 65 ]. Neste estudo, foi demonstrado que a curcumina foi aplicada topicamente em grande parte localizada na almofada de gordura infrapatellar (Fig.  4a ). Demonstramos ainda que este tratamento levou à redução da expressão de adipocitoquinas e mediadores pró-inflamatórios na almofada de gordura (Fig.  4b ). Estes dados sugerem que a curcumina pode retardar a progressão da doença na OA, pelo menos em parte, ao mitigar os efeitos mediadores pró-inflamatória da cartilagem nas articulações IPFP e articulares.

Neste estudo, que fornece a primeira evidência para demonstrar a eficácia da curcumina na OA doença e sintoma de modificação utilizando um modelo de rato pós-traumático OA. Além de lesões traumática da articulação, outras condições, tais como o uso excessivo mecânica e envelhecimento são factores de risco para a OA [ 66 , 67 ]. Avaliar a eficácia da curcumina em outros modelos OA relevantes, tais como OA induzida pelo uso excessivo e OA espontânea, o que representa OA relacionada com a idade, será de interesse.

conclusões

Usando um modelo pós-traumático rato OA, que fornecem a primeira evidência de que a curcumina tem eficácia significativa em retardar a progressão da doença OA e um efeito substancial no alívio da dor. A curcumina pode exercer a sua eficácia através do controlo de um largo espectro de moléculas incluindo proteinases predominantes na degradação da cartilagem, tais como a colagenase MMP-13, e agrecanase ADAMTS5 em condrócitos. Os efeitos condroprotetor de curcumina, quando administrados por via tópica, por meio de actuar, pelo menos em parte, a supressão de adipocitoquinas relevantes e outros mediadores pró-inflamatórios que são críticos para a homeostase da cartilagem na almofada de gordura infrapatellar.

abreviaturas

ADAMTS, Proteína Adam com motivos de trombospondina; ANOVA, análise de variância; CEBPA, CCAAT / enhancer alfa proteína de ligação; CITED2, o CBP / p300 interagindo transativador com a cauda rica em ED 2;COL2A1, colagénio 2A1; COX-2, ciclo-oxigenase-2; DMEM, meio de Eagle modificado por Dulbecco; DMM, a desestabilização do menisco medial; H & E, hematoxilina e eosina; IL-1β, interleucina-1 beta; IPFP, infrapatellar almofada de gordura; MMP, metaloproteínase de matriz; MMTL, ligamento medial meniscotibial; NF-kB, fator nuclear kappa B; AINE, não-esteróide anti-inflamatório; OA, osteoartrite; OARSI, Osteoarthritis Research Society Internacional; PBS, solução salina tamponada com fosfato; PGE 2 , prostaglandina E2; PPARg, gama PPAR; TMOS, tetra-metil-orthosilicate; TNF-α, factor de necrose tumoral-alfa.

declarações

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pelo NIH Grant R01AR050968 (HBS), a Arthritis Foundation (HBS), NIH Grant P01 HL110900 (JMF), e uma bolsa de pesquisa patrocinado partir NanoBiomed. Inc. (JMF, MN).

Contribuições dos autores

ZZ e DJL contribuiu para delineamento experimental, a cirurgia animal, administração curcumina, coloração histológica e análise e estudos de avaliação de dor, e elaborou o manuscrito. LX contribuiu para a cirurgia animal, curcumina administração e revisão do manuscrito. ZH efectuou os estudos in vitro e participou na revisão do manuscrito. AW contribuiu para coloração histológica e revisão do manuscrito. MN contribuiu para produzir as nanopartículas de curcumina e revisão do manuscrito. SJK contribuiu para a aquisição de espécimes humanos e revisão do manuscrito. DMH contribuiu para aquisição de espécimes humanos, design experimental, e revisão do manuscrito. JAH contribuiu para delineamento experimental e revisão do manuscrito. NJC contribuíram para a concepção do estudo e revisão do manuscrito. JF contribuíram para a concepção do estudo e revisão do manuscrito. HBS contribuíram para a concepção do estudo e delineamento experimental, analisou os dados, e finalizou o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Interesses competitivos

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes, com excepção do JMF e MN que estão parcialmente financiado através NanoBiomed. Inc.

Acesso AbertoEste artigo é distribuído sob os termos da Licença Internacional 4.0 Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ), que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que você dê crédito apropriado ao autor original (s) e da fonte, fornecer um link para a licença Creative Commons, e indicar se as alterações foram feitas. A renúncia Dedicação Creative Commons Public Domain ( http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/ ) aplica-se aos dados disponibilizados neste artigo, salvo indicação contrária.

arquivo adicional

Arquivo adicional 1:. Figura S1 não-encapsulado curcumina reduz MMP-13 de expressão de ARNm de uma maneira dose e dependente do tempo. Condrócitos primários humanos foram tratados com curcumina a concentrações indicadas (0-200 uM) durante 6 horas ( A ) ou tratados com a curcumina, a 100 uM em diferentes durações (0-48 horas) ( B ) na presença de IL-1β. *P <0,05, t teste ou one-way ANOVA com o teste post-hoc de Tukey, n = 3 / grupo. (DOCX 116 kb)

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