CONHEÇA SOBRE AS DOENÇAS REUMÁTICAS
ESTE BLOG TEM COMO FINALIDADE ALERTAR AS PESSOAS SOBRE OS SINTOMAS DAS DOENÇAS REUMÁTICAS PARA QUE AO RECONHECEREM OS PRIMEIROS SINTOMAS PROCUREM UM MÉDICO, POIS SOMENTE ELE PODERÁ DAR O DIAGNOSTICO CORRETO E PRESCREVER O MEDICAMENTO EXATO.
CSF-1 ou IL-34 de estimulação CSF1R promove a diferenciação de macrófagos, e activação de osteoclastogénese, e a inibição farmacológica de CSF1R é benéfico em modelos animais de artrite. O objetivo deste estudo foi determinar as contribuições relativas de CSF-1 e IL-34 de sinalização para CSF1R na AR.
Métodos
CSF-1 e IL-34 foram detectados por imuno-histoquímica e análise de imagem digital no tecido sinovial de artrite reumatóide biológica 15-ingénuo (RA), artrite psoriática 15 (PSA) e 7 pacientes com osteoartrite (OA). A expressão de genes em CSF-1- e macrófagos humanos IL-34 diferenciadas foi avaliada por análise FACS e por PCR quantitativo. RA explantes sinoviais foram incubadas com o CSF-1, IL-34, anticorpo de controlo (AB) ou neutralizante / bloqueio Abs segmentação de CSF-1, IL-34, ou CSF1R. O efeito de um Ab CSF1R-bloqueio foi examinada na artrite induzida por colagénio murino (CIA).
Resultados
CSF-1 (também conhecido como M-CSF) e IL-34 foi semelhante na AR e o PSA do tecido sinovial, mas inferior em controlos ( P <0,05). CSF-1 foi observada expressão no sublining sinovial, e IL-34 no sublining e a camada de revestimento da íntima. CSF-1 e IL-34 diferencialmente regulada a expressão de 17 336 de genes associadas a inflamação em macrófagos, incluindo quimiocinas, componentes de matriz extra-celulares, e as metaloproteinases de matriz. Exógena de CSF-1 ou IL-34, ou a sua neutralização independente, não teve efeito sobre RA explante sinovial produção de IL-6. Anti-CSF1R Ab reduziu significativamente IL-6 e outra de produção mediador inflamatório na AR explantes sinoviais, ea pata inchaço e destruição das articulações em CIA.
conclusões
a inibição simultânea de ambas as interacções CSF1R com CSF-1 e IL-34 suprime a activação inflamatória do tecido sinovial RA e patologia na CIA, sugerindo uma nova estratégia terapêutica para a AR.
fundo
A artrite reumatóide (AR) é uma doença auto-imune crônica que afeta as articulações periféricas, levando a deformidade articular e destruição [ 1 ]. Macrófagos sinoviais, através da sua capacidade de libertação de citocinas inflamatórias, metaloproteinases de matriz (MMPs), quimiocinas, oxigénio e azoto, intermediários reactivos e prostanóides, desempenham um papel central no processo patológico da AR [ 2 ]. Importante, números de macrófagos e produtos de citoquinas são associadas com a actividade da doença e progressão da doença em RA, e diminui em CD68 + sublining sinovial macrófagos representam um biomarcador sensível de tratamento eficaz [ 2 ]. Portanto, as estratégias especificamente concebido para atingir a activação, sobrevivência, diferenciação ou pró-inflamatória de macrófagos no tecido sinovial pode ser de benefício terapêutico na AR [ 2 , 3 ].
Factores de estimulação de colónias (CSF) e citocinas funcionalmente relacionados regular o desenvolvimento linhagem mielóide celular, proliferação, sobrevivência, mobilização, diferenciação e ativação na saúde e na doença [ 4 ]. De granulócitos-macrófagos CSF (GM-CSF) desempenha um papel importante na promoção da diferenciação de granulócitos e macrófagos a partir de precursores hematopoiéticos [ 4 ]. Durante a inflamação esta propriedade de GM-CSF pode ser importante para o recrutamento de monócitos sustentada imaturos para tecidos afectados [ 5 , 6 , 7 ]. O GM-CSF pode também contribuir directamente para a inflamação pela polarização em macrófagos um fenótipo pró-inflamatória, e a forma de redes de citoquina com outras citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF e de interleucina (IL) -1β [ 8 , 9 ]. A administração exógena de GM-CSF tem sido demonstrada para exacerbar a artrite induzida por colagénio (CIA) em ratinhos, enquanto que os ratinhos deficientes na expressão de GM-CSF estão protegidos contra a doença neste modelo de artrite [ 6 , 10 , 11 , 12 , 13 ]. Adicionalmente, os anticorpos neutralizantes (ABS) contra a exposição de GM-CSF tanto eficácia profilática e terapêutica na artrite experimental [ 6 , 14 ]. A relevância direta destas descobertas a RA é exemplificado em ensaios clínicos recentes em que um Ab bloqueando dirigidas à cadeia alfa do receptor de GM-CSF demonstrou segurança e eficácia [ 15 , 16 ].
Factor estimulante de colónias-1 (CSF-1), através da ligação ao CSF1R receptor tirosina-quinase (também conhecido como c-fms), também promove a sobrevivência, proliferação e diferenciação de células mielóides, incluindo monócitos, macrófagos e osteoclastos [ 4 , 17 ]. CSF-1 desempenha um papel distintamente diferente da de GM-CSF na mielopoese, agindo como um factor de diferenciação e de sobrevivência para monócitos maduros circulam Ly6C ( eis em ratinhos, CD16 + em seres humanos) e macrófagos teciduais residentes [ 6 , 17 , 18 ]. Na AR, CSF-1 é produzida principalmente pelas células endoteliais sinoviais, mas estudos in vitro indicam que os fibroblastos sinoviais e condrócitos estimuladas com TNF ou IL-1β também produzir CSF-1 [ 19 , 20 , 21 ]. Os modelos animais mostraram que a administração exógena de CSF-1, como o GM-CSF, exacerba a incidência e gravidade da CIA, enquanto o anti-CSF-1 Ab, eliminação genética de CSF-1, e inibidores farmacológicos de CSF1R reduzir a gravidade da experimental reumatóide [ 11 , 12 , 22 , 23 ]. CSF-1 também tem uma função essencial na destruição das articulações, como CSF-1 é necessário para osteoclastog�ese e osteólise induzida por TNF [ 24 , 25 ].
IL-34 foi descoberto recentemente como um novo ligando de CSF1R através da sua capacidade para suportar monócitos viabilidade [ 26 ]. CSF-1 e IL-34 partes estruturais, mas não de homologia de sequência, e tem efeitos em grande parte sobrepostas no CSF1R de sinalização a jusante, a regulação da sobrevivência dos monócitos, macrófagos polarização, e osteoclastog�ese [ 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 ]. No entanto, durante o desenvolvimento murino, a IL-34 desempenha um papel não redundante na geração de células de Langerhans e microglia [ 33 , 34 ]. Estudos recentes têm relatado que a IL-34 os níveis são elevados no soro, fluido sinovial, e do tecido sinovial de pacientes com AR, e como CSF-1, IL-34 é induzido por TNF e IL-1β na AR sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLS ) [ 35 , 36 , 37 , 38 ]. O objetivo deste estudo foi determinar as contribuições relativas de CSF-1 e IL-34 a CSF1R dependente inflamação na AR.
Métodos
Os pacientes e doadores de tecidos
Biópsias sinoviais foram obtidos por artroscopia agulha conforme anteriormente descrito a partir de articulações clinicamente activo em pacientes com RA (n = 15), artrite psoriática (PSA) (n = 15), ou a osteoartrite (OA) (n = 7), como previamente descrito [ 39 ]. Pacientes com AR e PSA preenchidas as 1987 do American College of Rheumatology critérios para a RA e a classificação dos critérios do estudo artrite psoriática (CASPAR), respectivamente [ 40 , 41 ]. Características clínicas dos pacientes estão detalhadas no arquivo adicionais 1 : Tabelas S1 e S2. Todos os pacientes deram o seu consentimento informado por escrito antes de estudar a inclusão, e este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Centro Médico Acadêmico da Universidade de Amsterdam, e de acordo com a Declaração de Helsinki.
análise de imagens imuno-histoquímica e digitais
As secções em série de seis amostras de biópsia incorporado-TissueTek diferentes por paciente foram cortadas com um criostato (5 uM), fixadas com acetona, e a actividade da peroxidase endógena com peróxido de hidrogénio bloqueado de 0,3% em 0,1% de azida de sódio salino / tamponada com fosfato. As secções foram coradas durante a noite a 4 ° C com Abs contra CSF-1 (R & D), IL-34 (M4, fornecidos por cinco Prime Therapeutics Inc.) e CD68 (Dako). Concentrações equivalentes de Abs monoclonal de ratinho irrelevante foram utilizados como controlos negativos. As secções foram então lavadas e incubadas com peroxidase de cabra anti-ratinho de rábano (HRP) (Dako), excepto no caso do anticorpo anti-IL-34 Ab, o qual foi seguido de incubação com tiramida biotinilado e estreptavidina-HRP. Os cortes foram desenvolvidos com amino-etilcarbazol (AEC, Vector Laboratories), contrastadas com hematoxilina de Gill (Klinipath), e montados em gelatina glicerol de Kaiser (Merck). Secções coradas foram analisadas por análise de imagem assistida por computador, utilizando o sistema de análise de Qwin (Leica) como previamente descrito em detalhe [ 42 ]. Os valores de densidades ópticas integradas (IOD) / mm 2 foram obtidas e corrigidas para o número total de núcleos / mm 2 . Os dados foram apresentados como o número de células positivas / mm 2 para a análise quantitativa de marcadores específicos de células do tipo-.
purificação de monócitos e diferenciação de macrófagos
Células mononucleares humanas foram isoladas de revestimentos de voluntários sangue do dador buffy (Sanquin), do sangue periférico a partir de controlos saudáveis e de pacientes com AR, e a partir de fluido sinovial de doentes com AR através de centrifugação com gradiente de Lymphoprep (Axis-Shield popas) e monócitos foram ainda isoladas por gradiente de Percoll separação (GE Healthcare). Os monócitos foram diferenciadas em macrófagos em IMDM / 10% de soro fetal de vitelo (FCS) suplementado com 100 ug / ml de gentamicina (Invitrogen), na presença de GM-CSF humana (5 ng / ml, R & D Systems), CSF-1 (25 ng / ml, R & D Systems), ou IL-34 (25 ng / ml, fornecida pelo Cinco Prime Therapeutics Inc.) durante 7 dias.
A citometria de fluxo
pureza de macrófagos e diferenciação foram avaliadas por citometria de fluxo (FACS Canto Citómetro de fluxo, BD Biosciences). foram usadas Abs monoclonais marcados com fluorocromo contra CD14 (eBiosciences), CD206 e CD163 (BD Pharmingen, tanto a partir), CD64 (BioLegend), e concentrações equivalentes de Abs de controlo de isotipo. Antes da coloração, receptores de Fc foram bloqueados com 10% de soro humano (Lonza). Os dados foram analisados com o software FlowJo Fluxo de Análise de Citometria (Árvore Star). Os valores foram expressos como a razão entre a intensidade de fluorescência média geométrica (GEOMEAN) do marcador de interesse em relação ao do controlo isotipo.
morte celular de macrófagos e a viabilidade
morte celular de macrófagos foi avaliada por iodeto de (PI) de coloração de anexina V-propídio. GM-CSF-, IL-34-, e macrófagos no sangue periférico de dadores saudáveis e no sangue periférico e líquido sinovial de pacientes com AR CSF-1 diferenciadas foram coradas com Anexina V (diluição de 1: 100, produtos iQ) e PI ( diluição de 1: 100, produtos iQ) e medida usando um FACS Canto citómetro de fluxo. Os dados foram analisados com o software FlowJo Fluxo de Análise de Citometria. Os valores foram expressos como a percentagem de células Anexina V-PI-positivas duas vezes. Macrófagos viabilidade foi avaliada pelo ensaio de calceína. Os monócitos a partir de buffy coat foram diferenciadas em macrófagos com meio sozinho, CSF-1 ou IL-34 e de proliferação celular foi analisada nos dias 1, 3 e 7 por coloração com Calcein-AM (1 uM, BD Bioscience) e análise utilizando um multi leitor -label Victor3 ™ (PerkinElmer Inc.). Os dados foram expressos como sinal em unidades arbitrárias.
quantitativos (q) matrizes de PCR em tempo real (RT) e PCR
ARN a partir de biópsias sinoviais congelados ou de GM-CSF-, e IL-34- macrófagos CSF-1 diferenciadas foi isolado utilizando o Kit RNeasy e isenta de RNase DNase Conjunto (Qiagen). Características clínicas dos pacientes estão detalhadas no arquivo adicionais 1 : Tabela S3. O ARN total foi transcrito reverso usando SuperScript II RT ™ (Invitrogen). Reacções de PCR foram realizadas duplicado utilizando SYBR Green (Applied Biosystems) com um sistema de detecção de sequência ABI 7000 Prism® (Applied Biosystems). DNA complementar (cDNA) foi amplificado utilizando primers específicos (Invitrogen) (ver arquivo adicionais 1 : Tabela S4). Níveis relativos de expressão de genes foram normalizados para a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase ( GAPDH gene de manutenção). O ARN mensageiro expressão (ARNm) foi apresentada como duas -ΔCt ou a quantidade relativa (RQ, 2 -ΔΔCt ). Alternativamente, o RNA total foi sujeito a síntese de ADNc, utilizando um TA 2 kit First Strand (Qiagen) e a expressão de ARNm de 336 genes relacionados com a inflamação foi analisada por RT-qPCR utilizando baixa densidade matrizes qPCR (Factores de crescimento angiogénicos Humano & Angiogenesis Inhibitors, Extracelular Humana matriz & Moléculas de Adesão e TGFß / BMP via de sinalização de PCR Arrays Humanos, Qiagen). Níveis relativos de expressão de genes foram normalizados para cinco genes de manutenção e os valores de RQ determinada como acima.
anticorpos
CSF-1 anti-humano Ab, clone 26730, um neutralizante de ratinho Ab monoclonal IgG2a, foi adquirido a R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EUA. Anti-humano IL-34 Abs M2 e M4 foram fornecidos por cinco Prime Therapeutics. M2 e M4 Abs monoclonais foram preparados por imunização de ratinhos Balb / c com purificada de IL-34 humana produzida em cinco Therapeutics Prime, seguido por procedimentos de hibridoma padrão e purificação de proteínas. Todos os experimentos com animais neste estudo foram realizados em conformidade com os protocolos adequadas aprovadas pelo Comité Cuidado e Uso Institucional animal at Five Prime Therapeutics e Bolder Biopath (Boulder, CO, EUA). O M2 Ab foi determinada como sendo um Ab de bloqueio, e da M4 Ab foi determinada como sendo não-bloqueio Ab por meio de testes sobrenadante de hibridoma quanto à sua capacidade para bloquear biotinilado IL-34 de ligação ao ser humano CSF1R-Fc num formato de ELISA, e testando a capacidade de Ab purificado para neutralizar a sobrevivência dos monócitos humanos primários de IL-34 mediada. CSF1R anti-humano Ab huAB1, um IgG4 humanizado, monoclonal Ab, foi fornecida por cinco Prime Therapeutics. huAB1 bloqueia a ligação de ambos CSF-1 e IL-34 para o CSF1R humano, inibindo desse modo vias de sinalização mediadas por CSF1R (ver arquivo adicional 2 : Figura S1a). Anti-rato CSF1R Ab muAB5, foi fornecida por cinco Prime Therapeutics e é uma IgG1 quimérico, monoclonal Ab consistindo de regiões V de rato e regiões C murino. muAB5 bloqueia a ligação de ambos rato CSF-1 e rato IL-34 ao CSF1R rato, inibindo assim as respostas mediadas pelo CSFR (ver arquivo adicionais 2 : Figura S1b). O tratamento anti-CSF1R em murganhos foi relatado para reduzir selectivamente periféricas Ly6C Lo monócitos não tendo qualquer efeito sobre Ly6C oi números de monócitos [ 6 , 18 ]. Para avaliar o impacto da anti-ratinho CSF1R muAB5 em monócitos periféricos, nos ratinhos tratados com 20 mg / kg de solução salina e muAB5 ou 7 dias depois quantificada populações de monócitos no sangue. Anti-CSF1R muAB5 selectivamente reduzido o número de monócitos Ly6Clo enquanto teve pouco ou nenhum efeito sobre os monócitos Ly6Chi (ver arquivo adicionais 2 : Figura S2).
Ensaios de explantes de biópsia sinovial
Intactas biópsias sinoviais (5 mm 3 ) foram obtidas a partir dos joelhos de pacientes com AR e foram cultivadas, três biópsias por condição, durante 24 h em DMEM completo suplementado com 10% de FCS e estimulados durante 24 h com concentrações crescentes de IL-34 humana ou CSF-1. Alternativamente, os explantes foram cultivados durante 96 horas com anti-humano CSF-1 (5 ug / ml), anti-IL-34 (5 ng / ml, m2), concentrações crescentes de CSF1R anti-humano Ab (huAB1), ou os seus respectivos controlos isotípicos humanos (Eureka Terapêutica). Os sobrenadantes de cultura de tecidos isentos de células foram colhidas para análise de citocina. Características clínicas dos pacientes estão detalhadas no arquivo adicionais 1 : Tabela S4.
A medição da produção de citoquinas
Os sobrenadantes isentos de células a partir de biópsias sinoviais foram analisados por ELISA para IL-6 (kits de ELISA ™ PelKine compacto, Sanquin Reagents). CCL2, CCL-7, ENA-78, SDF-1, MIG, GCP-2, TAC, NAP-2, IP-10, IL-1β, TNF-α, CXCL-8, MMP-2, MMP-7, e MMP-9 foram medidos utilizando os ensaios individuais-Plex humanos (Bio-Rad) e lidas num sistema 200 de Bio-Plex (Bio-Rad).
Efeitos de anti-CSF1R AB em homeostase mielóide murino
Indução e avaliação da CIA e análise histopatológica
Os modelos do rato da CIA foram estabelecidos em Bolder Biopath. Macho DBA / 1 machos (12 / grupo) foram injectados por via intradérmica na base da cauda com 150 uL de adjuvante completo de Freund contendo colagénio bovino tipo II (2 mg / ml) no dia 0 e no dia 21. Para os ratos de tratamento profilático foram doseados , começando no dia 0 com veículo, Enbrel a 10 mg / kg, ou muAB5 a 30 mg / kg. A continuação do tratamento três vezes por semana até ao dia 32. feridas clínicos em uma escala de 0-5 foram determinados para cada uma das patas em dias de estudo 18-35. O estudo foi encerrado no dia 35 e foi colhido sangue.Patas traseiras e joelhos foram coletadas em terminação e processados para análise histológica, conforme detalhado no arquivo adicional 3 : métodos suplementares. Para tratamento terapêutico, os ratinhos foram imunizados como descrito acima e distribuídos aleatoriamente por grupos de tratamento uma vez que, obviamente, o edema foi estabelecidas em, pelo menos uma pata. Pontuações médias de grupo foram 0,5-1,0 (de uma possível pontuação máxima de 5,0) no momento da inscrição. O tratamento com veículo, Enbrel a 10 mg / kg, ou muAB5 a 30 mg / kg foi iniciada após a inscrição e continuou três vezes por semana até ao dia 20 de artrite com ratinhos terminadas no dia 23 de artrite. A exposição a drogas tal como medido pela concentração plasmática terminal estava abaixo do limite de detecção em 3 dos 12 animais no grupo tratado com muAB5. Estas amostras deram resultados positivos para anticorpos anti-droga (dados não mostrados), os quais provavelmente contribuiu para a pobre exposição. Com base nestas descobertas, estas 3 animais com níveis de droga detectáveis foram excluídos de qualquer análise do estudo e interpretação: 7 dos 12 animais no grupo tratado com Enbrel também não tinha fármaco detectável na terminação e foram excluídos da análise.
análise TRAP5b
banda de soro de rato 5 tartarato resistente fosfatase ácida isoforma b (TRAP5b) foi medida no ratinho de plasma EDTA utilizando um kit de ELISA comercial (ratoeira ™ Assay, Immunodiagnostic Systems, Inc.) de acordo com as instruções do fabricante, incluindo uma diluição de 1: 4 de todos As amostras de plasma, utilizando em vez de soro. Cada amostra foi testada em singuleto. A curva de absorção padrão vs. dados de concentração foram ajustados a uma logística de quatro parâmetros para o cálculo dos resultados do ensaio.Os resultados são reportados em unidades / litro (L / G).
análise estatística
A análise estatística foi realizada usando o Windows GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). As diferenças de potencial entre os grupos experimentais foram analisados pelo teste de Mann-Whitney não paramétrico U de teste, teste de Kruskal-Wallis, Friedman ou teste emparelhado, como adequado. P valores <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Resultados
expressão tecido sinovial de CSF-1, IL-34 e CSF1R
Em primeiro lugar, investigou-se a expressão de CSF-1, IL-34 e CSF1R no tecido sinovial de pacientes com AR ou PSA opcionais. análise qPCR não identificou diferenças entre pacientes com AR e PSA na expressão de mRNA de IL-34, CSF-1, ou seus receptores (Fig. 1a ). A análise imunohistoquímica do tecido sinovial independentemente confirmado que a IL-34 (Fig. 1b ) e CSF-1 (Fig. 1c ) são expressas em tecido sinovial na AR, AP e de OA. Enquanto a IL-34 é expresso no sublining sinovial e a camada de revestimento da íntima, CSF-1 expressão foi limitada principalmente para as áreas em torno dos vasos sanguíneos. Na quantificação digital coloração para cada citocina, IL-34 e CSF-1 expressão da proteína foi semelhante em tecido sinovial na AR, AP e OA (Fig. 1d ). Em conjunto, estes dados demonstram que tanto a IL-34 e CSF-1 são expressos em níveis semelhantes na membrana sinovial de pacientes com artrite inflamatória e não inflamatória.
FIG. 1
Factor estimulante de colónias-1 (CSF-1), IL-34 e receptor de CSF1 ( CSF1R ) são expressas em tecido sinovial de pacientes com artrite reumatóide ( AR ) e artrite psoriática ( PsA ). Uma quantificação de IL-34, FEC relativa expressão -1 e mRNA CSF1R no tecido sinovial a partir de 6 pacientes com AR e 6 com APs. Os dados de PCR quantitativas são mostradas como quantidade relativa ( RQ ), conforme descrito em " Métodos ". Os dados são apresentados como gráficos de dispersão, em que cada trama representa um valor individual, barras representam a média, e as barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM). B , c imunohistoquímica análises de AR, AP e de tecido sinovial OA coradas com controle coelho, anti-IL34 ( b ) e anticorpos anti-CSF1 ( c ). d análise quantitativa de IL-34 e CSF-1 coloração no tecido sinovial. Seções sinoviais de 15 pacientes com AR, 15 com AP e 7 pacientes com osteoartrite ( OA ) foram coradas com anticorpos contra a IL-34 e CSF-1 anticorpos como acima, e a densidade óptica integrada ( IOD / mm 2) corrigidos para celularidade foi calculada por análise de imagem digital. Cada loterepresenta um valor individual, barras representam a média e barras de erro indicam o SEM. * P <0,05
IL-34 e CSF-1 induzem padrões de expressão gênica similares, mas distintas em macrófagos humanos
Dado que a IL-34 e CSF-1 localizada em regiões distintas da membrana sinovial e macrófagos em camadas sublining e forro da íntima sinoviais RA e PSA exibir características fenotípicas distintas [ 43 ], foi examinada a influência destas duas citocinas no sangue periférico a partir de HD e pacientes com AR, e sua influência na diferenciação sinovial derivadas de fluido de monócitos, proliferação e expressão de genes em RA. Para testar isto, nós diferenciadas monócitos a partir de células mononucleares de buffy coat em sangue de HD, e sangue periférico e no fluido sinovial de doentes com RA com CSF-1 (CSF-1 MO), IL-34 (IL-34 MO) ou GM -CSF (GM-CSF MO). Em primeiro lugar, analisaram o efeito de IL-34 e CSF-1 sobre a proliferação de macrófagos e sobrevivência. Nós não observaram diferenças na sobrevivência das células em IL-34 MO e CSF-1 MO; no entanto, houve uma tendência para uma maior morte celular em comparação com GM-CSF MO (Fig. 2a ). Não foi observada qualquer diferença na viabilidade celular entre macrófagos derivados de células mononucleares no sangue periférico de HD ou de pacientes com AR, nem entre e macrófagos derivados de líquido sinovial em pacientes com AR (Fig. Derivadas de sangue periférico 2a ). Nós também descobrimos que tanto CSF-1 e IL-34 promoveu a sobrevivência de células da mesma forma, e aumentou significativamente a viabilidade em relação à macrófagos diferenciados em meio sozinho ( p <0,05, veja arquivo adicionais 2 : Figura S3).
FIG. 2
IL-34 e factor estimulante de colónias-1 ( CSF-1 macrófagos) têm características fenotípicas semelhantes. Umacélula activado por fluorescência (FACS) de anexina iodeto de V-propídio ( PI manchamento) nos macrófagos diferenciados durante 7 dias em granulócitos-macrófagos factor estimulante de colónias ( GM-CSF ) (5 ng / mL), CSF-1 (25 ng / ml) ou IL-34 (25 ng / ml) a partir de sangue periférico e no fluido sinovial de dadores saudáveis ( HD ) e pacientes com artrite reumatóide (AR). Os dados são apresentados como percentagem de células positivas duas vezes e representam a média ± erro padrão da média (SEM) de 3-4 experiências independentes. B , c análise por FACS da expressão de marcadores de superfície de macrófagos CD14, CD163, CD206, CD64 e em macrófagos diferenciados durante 7 dias em GM-CSF, CSF-1 ou IL-34 derivada de monócitos de buffy coat ( b ) ou de monócitos de sangue periférico de HD ou pacientes com AR ( OP ), ou a partir de fluido sinovial de pacientes com AR ( SF ) ( C ).Os dados são apresentados como a média geométrica ( geo significar ) e representam a média ± SEM de 4-5 experiências independentes por marcador. * P <0,05, ** P <0,01 e *** P <0,001
Em seguida, examinámos a expressão de marcadores de polarização recentemente validados para os macrófagos humanos [ 43 ]. Observou-se que a expressão de CD14, CD163, CD206 e CD64 foi semelhante em IL-34 MO e CSF-1 MO, independentemente se os macrófagos foram obtidos a partir de sangue periférico a partir de HD, ou sangue periférico ou fluido sinovial de pacientes com AR. Em contraste, o GM-CSF tinha MO expressão significativamente mais baixa de CD14 e CD163, e de expressão elevada de CD206 e CD64 (Fig. 2be na Fig. 2c ).
Finalmente, examinámos a expressão de ARNm de 336 genes relevantes para RA, envolvidos na angiogénese, remodelação da matriz extracelular e a formação de osteoclastos. Na análise clustergrama sem supervisão, GM-CSF MO derivada a partir de sangue periférico a partir de HD agrupado distintamente diferenciada em comparação com aqueles da IL-34 ou de FEC-1 (Fig. 3a ), como esperado. IL-34 e CSF-1 MO estavam intimamente relacionadas, com mais diferenças globais entre doadores de monócitos do que a citocina usado para diferenciação. No entanto, apesar da forte relação na expressão genética entre macrófagos diferenciados em IL-34 e CSF-1, que identificou uma série de genes que foram significativamente upregulated no CSF-1 MO, incluindo CXCL5 , Tie1 , LMBP2 , Cdc25A , ITGA6 , LAMAC1 , ECM1 , e ITGB5 (Fig. 3a ). Em contraste, a expressão de CXCL12 , SERPINF1 , MMP2 , ACVRA2 , ITGAL , CDH11 , e TGFBR3 foi significativamente sobre-regulada de IL-34 MO (Fig. 3b e arquivo adicional 1 : Tabela S5). Nós também examinou se IL-34 e CSF-1 MO diferenciado do líquido sinovial (SF) monócitos na AR tinham diferentes padrões de expressão em genes relacionados com a remodelação da matriz extracelular. Observamos regulação positiva de ADAMTS1 , MMP3 , MMP7 , ITGA1 , LAMA1 , LAMA3 , LAMB3 e SSP1 no CSF-1 MO, enquanto CDH11 , MMP2 e ITGB4 foram upregulated em IL-34 MO (Fig. 4 ). Juntos, estes resultados sugerem que, embora a IL-34 e CSF-1 geram macrófagos fenotipicamente semelhantes, localizada diferencial de produção de IL-34 e CSF-1 na sinóvia pode potencialmente dar origem a macrófagos com capacidades funcionais discretos.
FIG. 3
A expressão de genes em macrófagos diferenciados. Um perfil de expressão de ARNm de 336 genes envolvidos na angiogénese, remodelação da matriz extracelular, e a formação de osteoclastos em factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos ( GM-CSF ) -, factor estimulante de colónias-1 ( CSF-1 ) macrófagos ou IL-34 diferenciadas (MO) derivadas de monócitos de cremes leucocitários (n = 3) -. Os dados são apresentados em uma clustergrama sem supervisão. B As análises dos níveis de genes selecionados analisados na expressão de mRNAum . Os dados são apresentados como a quantidade relativa ( RQ ) em relação a GM-CSF MO, conforme descrito em " Métodos "
FIG. 4
A expressão de genes em macrófagos diferenciados a partir de monócitos de fluido sinovial na artrite reumatóide (AR). As análises dos níveis de genes envolvidos na formação de remodelação da matriz extracelular na expressão de ARNm de factor estimulante de colónias-1 ( CSF-1 ) - macrófagos ou IL-34 diferenciadas (MO) derivada a partir de monócitos de fluido sinovial na AR (n = 3). Os dados são apresentados como a quantidade relativa ( RQ ) em CSF-1 MO, conforme descrito em " Métodos ". * P <0,05
CSF1R bloqueio reduz a produção de mediadores inflamatórios em tecido sinovial RA
Para estender o nosso conhecimento sobre o papel da CSF1R sinalização na AR, foram utilizados anticorpos bloqueadores para CSF-1 (clone 26730), a IL-34 (M2), ou para CSF1R (huMab1) para investigar os efeitos diferenciais de respostas de inibição para cada ligando de forma independente em relação a inibição de respostas ambos os ligandos, simultaneamente, por meio do bloqueio CSF1R. Em primeiro lugar, determinado o efeito da estimulação de IL-34 e CSF-1 na produção de citocinas em tecido sinovial RA. As experiências iniciais demonstraram que a adição de ambos IL-34 ou de FEC-1 não induziu a produção de IL-6 por Ra explantes sinoviais (Fig. 5a ). Para descartar a possibilidade de que o receptor de tipo proteína-tirosina ζ fosfatase (PTP-ζ), uma descoberta recente de IL-34 do receptor [ 44 ], poderia interferir na produção de IL-6, analisou-se a expressão do mRNA no tecido sinovial de pacientes com AR ou AP. Descobrimos que PTP-ζ foi expressa na membrana sinovial em ambas as doenças (ver arquivo adicionais 2 : Figura S4), ainda que em níveis muito baixos em comparação com CSF1R. Além disso, a neutralização de qualquer IL-34 sozinha (Fig. 5b ) ou de CSF-1 sozinho (Fig. 5c ) não influenciou a produção de IL-6 por explantes sinoviais. No entanto, a segmentação directa de CSF1R com huAb1, que bloqueia a ligação de IL-34 e CSF-1, significativamente reduzida explante sinovial de IL-6 a produção de uma forma dependente da dose, com uma inibição máxima já foi observado a uma concentração de Ab de 1 ug / ml (Fig. 5d ). huAB1 também reduziu significativamente a produção das quimiocinas CXCL-8, GCP-2, MIG, IP-10, CCL-2, CCL-7 e MMP-9 em tecido sinovial RA (Fig. 5e ), e observou-se uma tendência para uma redução na produção de TNF, IL-1β, ENA-78 e MMP-2, embora as diferenças não foram significativas (Fig. 5f ). Em contraste, não foram observadas diferenças na produção de SDF-1, TAC, NAP-2, e MMP-7 (dados não mostrados). Juntos, estes resultados demonstram que a inibição de sinalização CSF1R, mas a inibição não individual dos dois ligandos do receptor, é capaz de reduzir a produção de mediadores inflamatórios no tecido sinovial na AR.
FIG. 5
Estimulante do receptor anti-colónia factor-1 (anti-CSFR1) anticorpo reduz a produção de mediadores inflamatórios no tecido sinovial na artrite reumatóide (AR). Uma produção de ELISA de IL-6 nos sobrenadantes de tecido sinovial RA após 24 horas de incubação em meio sozinho ou concentrações crescentes de factor estimulante de colónias-1 (CSF-1 ) ou IL-34 (N = 7). b - d da IL-6 de produção de ELISA em sobrenadantes de tecido sinovial RA após 4 dias de incubação em meio sozinho na presença de IgG1 ou anti-IL-34 anticorpo (Ab) (5 ug / ml para ambos, n = 5) ( B ), anti-CSF-1 Ab (5 ug / ml, n = 3) ( c ), ou concentrações crescentes de IgG4 ou huAB1 (n = 5) ( d ). e , F análise multiplex de produção de proteína nos sobrenadantes de tecido sinovial RA após 4 dias de incubação em meio sozinho na presença de 1 ug / IgG4 ml ou 1 ug / ml huAB1 (n = 4). caixas representam os percentis 25-75th, linhas dentro das caixas de marcar o valor mediano e linhas fora das caixas representam os percentis 10 e 90. * P <0,05 e ** P <0,01
bloqueio CSF1R é protetora na CIA
Dada a eficácia do bloqueio CSF1R em tecido sinovial RA, examinámos o efeito do bloqueio anti-rato CSF1R muAB5 anticorpo in vivo utilizando o modelo de murídeo de artrite CIA. A administração profilática de muAB5 (30 mg / kg) reduziu significativamente a gravidade da artrite em comparação com o controlo de veículo (Fig. 6a ). As análises histológicas das patas traseiras dos ratinhos confirmou o efeito protector de muAB5, como as pontuações para a inflamação, danos na cartilagem, formação de pannus e erosão de osso foram todas melhoradas nos ratinhos tratados com muAB5 (Fig. 6b ). A análise semiquantitativa demonstrou que a administração muAB5 reduziu drasticamente e significativamente todos estes parâmetros analisados (Fig. 6c). Como a sinalização CSF1R também suporta osteoclastogênese, quantificamos os níveis séricos do marcador de reabsorção óssea, TRAP5b. Ratinhos tratados com anti-CSF1R tiveram uma redução significativa na TRAP5b comparação com ratinhos tratados com veículo (Fig. 6d ). Curiosamente, a administração de muAB5 foi mais eficaz do que o Enbrel (10 mg / kg) na redução da gravidade da artrite e na melhoria de todos histológico, radiológico, e parâmetros serológicos (Fig. 6A-D ). Tratamento anti-CSF1R foi associada a uma redução infiltração de macrófagos no tecido sinovial (Fig. 6e ). As patas dianteiras e joelhos dos ratinhos foram examinados por análise de imuno-histoquímica para a presença de macrófagos por F4 / 80 coloração.Números de macrófagos foram significativamente reduzidos em ratinhos tratados com muAB5 em comparação com controlo de veículo. Enbrel não teve efeito significativo sobre os números de macrófagos nos tecidos.
FIG. 6
O tratamento profilático com anti-receptor de factor de estimulação de colónias-1 ( anti-CSF1R ) impede a progressão patológica na artrite induzida por colagénio ( CIA ). Um diárias pontuações artríticas globais para ratos tratados intraperitonealmente a cada 3 dias com veículo, Enbrel, ou muAb5. O tratamento continuou três vezes por semana desde o dia 0 com veículo de controlo ( triângulos ), Enbrel (10 mg / kg) ( círculos ) ou muAb5 (30 mg / kg) (quadrados ). B Imagens representativas de aparências patológicas das articulações no tratamento indicado grupo, visualizadas por coloração com H & e. Nota as áreas representativas de infiltração celular sinovial e formação de pannus ( setas ). C inflamação ( I ), formação de pannus ( PF ), danos na cartilagem ( CD danos osso (), e BDcontagens) para ratinhos em cada grupo de tratamento. Os dados são média ± erro padrão da média (EPM) para cada grupo (n = 12 animais por grupo). # P <0,05 vs veículo e ** P <0,01. D , e Banda 5 tartarato resistente fosfatase ácida isoforma b ( TRAP5b ) níveis plasmáticos ( d ) e o número de células F4 / 80-positivos em cinco × 200 campos (e ) nas articulações inflamadas de ratinhos em cada grupo de tratamento. os símbolos representam os valores obtidos a partir de animais individuais, barras representam a média e erro barras indicam o SEM. # P <0,05 vs ingênuo e ### P <0,001 vs naïve. *** P <0,001
A seguir, analisou o efeito terapêutico do tratamento muAB5 no modelo CIA. muAB5 administrado após a indução de artrite significativamente inibiu a formação de pannus e destruição do osso (Fig. 7a ). Tratamento anti-CSF1R não têm um efeito significativo sobre os parâmetros histológicos de inflamação ou destruição da cartilagem. Neste estudo Enbrel também não teve nenhum efeito significativo sobre a inflamação da cartilagem ou destruição. O tratamento terapêutico com TRAP5b soro muAB5 também reduzido e o número de macrófagos dos tecidos (Fig. 7b e 7c ). A falta de um efeito de muAB5 sobre a inflamação, apesar de reduzir os números de macrófagos de tecido, é possivelmente devido ao facto de que a inflamação de fase final no modelo de ratinho CIA é em parte devido à alta infiltração de neutrófilos. Isto está em contraste com a AR humana em macrófagos que predominam.
FIG. 7
O tratamento terapêutico com anti-estimulação de colónias de receptor do factor-1 ( anti-CSF1R ) suprime a destruição óssea e formação de panos na artrite induzida por colagénio ( CIA ). Uma avaliação histopatológica de CIA em ratinhos tratados com veículo, Enbrel, ou muAB5 após o início do artrite. * P <0,05 e ** P <0,01 vs veículo. Iinflamação, PF formação de pannus, CD danos na cartilagem, BD osso danos. B , c da faixa 5 de fosfatase ácida isoforma b (resistente ao tartarato TRAP5b ) níveis plasmáticos ( b ) e número de células / 80-positivos F4 em cinco × 200 campos ( c ) nas articulações inflamadas de ratinhos em cada grupo de tratamento. os símbolos representam os valores obtidos a partir de animais individuais, barras representam a média, e as barras de erro indicam o erro padrão da média. ** P <0,01 vs veículo e ### P <0,001 vs naïve. *** P <0,001
Discussão
No presente estudo, foi demonstrado que os anticorpos específicos contra CSF1R, que impedem a ligação de ambos CSF-1 e IL-34 ao seu receptor, reduzir a gravidade da CIA e a produção de mediadores inflamatórios na AR explantes de tecido sinovial ex vivo. Por outro lado, a neutralização de CSF-1 ou IL-34 teve individualmente nenhum efeito detectável na expressão de genes inflamatória no tecido sinovial RA. Esta última observação foi surpreendente, como CSF-1 ou deficiência de neutralização em modelos animais de RA tem efeitos terapêuticos claros [ 11 , 12 ]. Os nossos dados podem sugerir que na CIA, CSF-1 desempenha um papel importante na promoção da diferenciação e sobrevivência de monócitos maduros na periferia antes ou em que estão a entrar no tecido inflamado, tal como observado em certos modelos murinos de pulmão e inflamação peritoneal [ 6 ], enquanto na AR explantes sinoviais, macrófagos sinoviais já não depende estão sobre CSF-1 sozinho. Em vez disso, os macrófagos podem também utilizar sinoviais de IL-34 como um factor de sobrevivência. Em conformidade com isso, CSF-1 e IL-34 são detectados em concentrações equivalentes em fluido sinovial de pacientes com AR, e aqui que confirmam e ampliam as observações anteriores de que tanto o CSF-1 e IL-34 são produzidas localmente na AR tecido sinovial [ 35 , 36 ]. No entanto, a estimulação de Ra biópsias sinoviais, quer com o CSF-1 ou IL-34 não conseguiu influenciar a expressão aguda de mediadores inflamatórios, possivelmente indicando que a produção sinovial endógena de CSF-1 e / ou IL-34 em RA é saturação no que diz respeito à disponibilidade CSF1R .
A nossa incapacidade para modular a expressão do gene AR explante sinovial por neutralização de CSF-1 e IL-34 suporta individualmente ainda mais a noção de que estas duas citocinas são largamente redundante no apoio a diferenciação e a sobrevivência da maior parte das populações de macrófagos de tecido. Algumas diferenças subtis foram observadas entre o CSF-1 e IL-34 na força e a cinética com os quais eles activam CSFR1 [ 30 , 31 , 32 ]. De facto, a análise da expressão do gene mundial de monócitos humanos diferenciados com IL-34 e M-CSF, revelou que dos genes regulados por estas citocinas, as diferenças quantitativas na indução foram observados cerca de 30% dos genes [ 45 ]. Consistente com isto, de 336 genes envolvidos em processos que contribuem para as alterações patológicas na AR, tais como angiogénese, inflamação e remodelação de tecidos, observou-se apenas 18 genes que foram diferencialmente expressos por CSF-1 e IL-34 MO. No entanto, como se observa que CSF-1 (detectado em células que rodeiam os vasos sanguíneos) e IL-34 (ao longo das camadas sublining e forro da íntima sinoviais) são expressos em diferentes regiões da membrana sinovial, estas citocinas poderiam potencialmente contribuir para a heterogeneidade fenotipica de macrófagos observados nos sublining e forro íntima camadas de membrana sinovial em artrite inflamatória [46 ].
Nossos resultados fornecem a primeira evidência direta de que a segmentação de CSF1R tem efeitos anti-inflamatórios em não só animal, mas também modelos humanos de AR estabelecida. Estudos anteriores observaram efeitos protetores contra alterações patológicas em modelos animais de RA utilizando inibidores farmacológicos da atividade CSF1R quinase [ 22 , 23 ]. No entanto, foram levantadas questões que estes compostos podem também atingir outras tirosina-quinases relevantes para alteração patológica na AR [ 17 ].Enquanto este manuscrito estava em preparação, Toh e seus colegas relataram que outra Ab específico do CSF1R poderia profilaticamente prevenir a inflamação e lesão das articulações em CIA [ 47 ]. Curiosamente, o mesmo anticorpo não suprimiu a inflamação no modelo de transferência de soro murino de artrite, enquanto retendo a sua capacidade de bloquear a cartilagem e osso destruição. Os autores atribuíram esta discrepância potencialmente diferencial papéis para recrutamento de macrófagos e ativação nesses modelos animais [ 47 ].
Da mesma forma, resultados conflitantes utilizando diferentes anticorpos bloqueadores CSF1R em outros modelos de doenças animais levaram a dúvidas sobre a viabilidade desta estratégia [ 17 ]. Por exemplo, o anti-Ab CSFR1 AFS98, o que reduz rapidamente monócitos e macrófagos de tecidos in vivo, confere protecção em modelos de murídeo de inflamação do pulmão e peritoneal [ 6 ]. No entanto, outro Ab M279, o que reduz os F4 / 80 hi Ly6 lo população de monócitos e macrófagos teciduais mais lentamente, não exibe efeitos anti-inflamatórios em modelos similares, mas agrava doença do enxerto contra hospedeiro [ 18 ]. A diferença na actividade de AFS98 e M279 poderiam ser devido a diferenças na função efectora de Fc [ 17 ]. AFS98 é uma IgG2a de rato com maior potencial para a função efectora de Fc em comparação com M279, que é uma IgG1 de rato. muAb5 é um IgG1 de rato e espera-se que têm baixa função efetora Fc, similar ao M279. Em nosso estudo, muAb5 reduzida a mesma população de monócitos circulantes observado com M279, mas forneceu proteção quase completa contra todos os parâmetros da doença em CIA.
Estes estudos levaram à sugestão de que em algumas doenças inflamatórias, a terapia anti-CSF1R pode agravar alterações patológicas, esgotando o tecido dos macrófagos teciduais residentes tolerizante e permitindo a sua substituição por populações de monócitos pró-inflamatórias, ou através da promoção da re pró-inflamatória polarização de macrófagos teciduais [ 17 ]. Estas preocupações só pode ser dirigida empiricamente na clínica, mas é de notar que o tratamento huAB1 reduziu a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, TNF, e IL-1), quimiocinas (CXCL-8, GCP-2, MIG , IP-10, CCL-2, e CCL7), e das MMPs (MMP-2 e MMP-9) em tecido sinovial RA. Isto sugere que o bloqueio CSF1R no tecido inflamado não resulta na conversão dos macrófagos sinoviais a um fenótipo funcional mais pró-inflamatória, consistente com observações recentes de que os estímulos ambientais presentes no tecido sinovial, tais como complexos de IgG e angiopoietinas, pode substituir as condições de polarização para regulam a expressão do gene de macrófagos [ 48 , 49 ]. Experimentação em biópsias sinoviais não pode abordar a possibilidade de que monócitos circulantes pró-inflamatórias pode substituir macrófagos sinoviais após o tratamento anti-CSF1R, mas os estudos de migração de monócitos usando a cintilografia em pacientes com AR indicou que a rotatividade de macrófagos no tecido sinovial é lento, e mesmo durante a terapia bem sucedida , a taxa de imigração de monócitos em tecido sinovial é inalterada [ 50 , 51 ], levantando a possibilidade de que o CSF-1 mantém populações distintas em monócitos do rato e do homem.
conclusões
interferência simultânea com CSF-1 e IL-34 para a sinalização CSF1R suprime a expressão de pró-inflamatória gene em tecido sinovial RA, e diminui a patologia em ambas as estratégias de tratamento profiláticos e terapêuticos na CIA, validando o CSF1R como um potencial alvo terapêutico na AR.
abreviaturas
AB:
anticorpo
CIA:
artrite induzida por colagénio
ADNc:
ADN complementar
CSF:
-factor estimulante de colónia
CSF1R:
colony - estimular o receptor do factor-1
DMEM:
meio de Eagle modificado por Dulbecco
EDTA:
ácido etilenodiaminotetracético
ELISA:
ensaio imunossorvente ligado a enzima
FACS:
separação de células activada por fluorescência
FCS:
soro fetal de vitelo
FLS:
sinovi�ito fibroblastos-like
GAPDH:
desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato
GM-CSF:
granulokine-macrófagos
HD:
dador saudável
HRP:
peroxidase de rábano
ELE:
hematoxilina e eosina
IOD:
densidades ópticas integradas
IL:
interleucina
MMP:
metaloproteinases da matriz
mRNA:
RNA mensageiro
OA:
osteoartrite
PI:
iodeto de propídio
AP:
artrite psoriática
RA:
artrite reumatóide
RQ:
quantidade relativa
RT-qPCR:
Em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa
SF:
fluido sinovial
TNF:
fator de necrose tumoral
TRAP5b:
banda de 5 resistente ao tartarato fosfatase ácida isoforma b
declarações
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada por uma bolsa de investigação aberto das Cinco Therapeutics Prime, Inc. para KAR.
Acesso AbertoEste artigo é distribuído sob os termos da Licença Internacional 4.0 Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ), que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que você dê crédito apropriado ao autor original (s) e da fonte, fornecer um link para a licença Creative Commons, e indicar se as alterações foram feitas. A renúncia Dedicação Creative Commons Public Domain ( http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/ ) aplica-se aos dados disponibilizados neste artigo, salvo indicação contrária.
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CSF-1 ou IL-34 de estimulação CSF1R promove a diferenciação de macrófagos, e activação de osteoclastogénese, e a inibição farmacológica de CSF1R é benéfico em modelos animais de artrite. O objetivo deste estudo foi determinar as contribuições relativas de CSF-1 e IL-34 de sinalização para CSF1R na AR.
Métodos
CSF-1 e IL-34 foram detectados por imuno-histoquímica e análise de imagem digital no tecido sinovial de artrite reumatóide biológica 15-ingénuo (RA), artrite psoriática 15 (PSA) e 7 pacientes com osteoartrite (OA). A expressão de genes em CSF-1- e macrófagos humanos IL-34 diferenciadas foi avaliada por análise FACS e por PCR quantitativo. RA explantes sinoviais foram incubadas com o CSF-1, IL-34, anticorpo de controlo (AB) ou neutralizante / bloqueio Abs segmentação de CSF-1, IL-34, ou CSF1R. O efeito de um Ab CSF1R-bloqueio foi examinada na artrite induzida por colagénio murino (CIA).
Resultados
CSF-1 (também conhecido como M-CSF) e IL-34 foi semelhante na AR e o PSA do tecido sinovial, mas inferior em controlos ( P <0,05). CSF-1 foi observada expressão no sublining sinovial, e IL-34 no sublining e a camada de revestimento da íntima. CSF-1 e IL-34 diferencialmente regulada a expressão de 17 336 de genes associadas a inflamação em macrófagos, incluindo quimiocinas, componentes de matriz extra-celulares, e as metaloproteinases de matriz. Exógena de CSF-1 ou IL-34, ou a sua neutralização independente, não teve efeito sobre RA explante sinovial produção de IL-6. Anti-CSF1R Ab reduziu significativamente IL-6 e outra de produção mediador inflamatório na AR explantes sinoviais, ea pata inchaço e destruição das articulações em CIA.
conclusões
a inibição simultânea de ambas as interacções CSF1R com CSF-1 e IL-34 suprime a activação inflamatória do tecido sinovial RA e patologia na CIA, sugerindo uma nova estratégia terapêutica para a AR.
fundo
A artrite reumatóide (AR) é uma doença auto-imune crônica que afeta as articulações periféricas, levando a deformidade articular e destruição [ 1 ]. Macrófagos sinoviais, através da sua capacidade de libertação de citocinas inflamatórias, metaloproteinases de matriz (MMPs), quimiocinas, oxigénio e azoto, intermediários reactivos e prostanóides, desempenham um papel central no processo patológico da AR [ 2 ]. Importante, números de macrófagos e produtos de citoquinas são associadas com a actividade da doença e progressão da doença em RA, e diminui em CD68 + sublining sinovial macrófagos representam um biomarcador sensível de tratamento eficaz [ 2 ]. Portanto, as estratégias especificamente concebido para atingir a activação, sobrevivência, diferenciação ou pró-inflamatória de macrófagos no tecido sinovial pode ser de benefício terapêutico na AR [ 2 , 3 ].
Factores de estimulação de colónias (CSF) e citocinas funcionalmente relacionados regular o desenvolvimento linhagem mielóide celular, proliferação, sobrevivência, mobilização, diferenciação e ativação na saúde e na doença [ 4 ]. De granulócitos-macrófagos CSF (GM-CSF) desempenha um papel importante na promoção da diferenciação de granulócitos e macrófagos a partir de precursores hematopoiéticos [ 4 ]. Durante a inflamação esta propriedade de GM-CSF pode ser importante para o recrutamento de monócitos sustentada imaturos para tecidos afectados [ 5 , 6 , 7 ]. O GM-CSF pode também contribuir directamente para a inflamação pela polarização em macrófagos um fenótipo pró-inflamatória, e a forma de redes de citoquina com outras citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF e de interleucina (IL) -1β [ 8 , 9 ]. A administração exógena de GM-CSF tem sido demonstrada para exacerbar a artrite induzida por colagénio (CIA) em ratinhos, enquanto que os ratinhos deficientes na expressão de GM-CSF estão protegidos contra a doença neste modelo de artrite [ 6 , 10 , 11 , 12 , 13 ]. Adicionalmente, os anticorpos neutralizantes (ABS) contra a exposição de GM-CSF tanto eficácia profilática e terapêutica na artrite experimental [ 6 , 14 ]. A relevância direta destas descobertas a RA é exemplificado em ensaios clínicos recentes em que um Ab bloqueando dirigidas à cadeia alfa do receptor de GM-CSF demonstrou segurança e eficácia [ 15 , 16 ].
Factor estimulante de colónias-1 (CSF-1), através da ligação ao CSF1R receptor tirosina-quinase (também conhecido como c-fms), também promove a sobrevivência, proliferação e diferenciação de células mielóides, incluindo monócitos, macrófagos e osteoclastos [ 4 , 17 ]. CSF-1 desempenha um papel distintamente diferente da de GM-CSF na mielopoese, agindo como um factor de diferenciação e de sobrevivência para monócitos maduros circulam Ly6C ( eis em ratinhos, CD16 + em seres humanos) e macrófagos teciduais residentes [ 6 , 17 , 18 ]. Na AR, CSF-1 é produzida principalmente pelas células endoteliais sinoviais, mas estudos in vitro indicam que os fibroblastos sinoviais e condrócitos estimuladas com TNF ou IL-1β também produzir CSF-1 [ 19 , 20 , 21 ]. Os modelos animais mostraram que a administração exógena de CSF-1, como o GM-CSF, exacerba a incidência e gravidade da CIA, enquanto o anti-CSF-1 Ab, eliminação genética de CSF-1, e inibidores farmacológicos de CSF1R reduzir a gravidade da experimental reumatóide [ 11 , 12 , 22 , 23 ]. CSF-1 também tem uma função essencial na destruição das articulações, como CSF-1 é necessário para osteoclastog�ese e osteólise induzida por TNF [ 24 , 25 ].
IL-34 foi descoberto recentemente como um novo ligando de CSF1R através da sua capacidade para suportar monócitos viabilidade [ 26 ]. CSF-1 e IL-34 partes estruturais, mas não de homologia de sequência, e tem efeitos em grande parte sobrepostas no CSF1R de sinalização a jusante, a regulação da sobrevivência dos monócitos, macrófagos polarização, e osteoclastog�ese [ 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 ]. No entanto, durante o desenvolvimento murino, a IL-34 desempenha um papel não redundante na geração de células de Langerhans e microglia [ 33 , 34 ]. Estudos recentes têm relatado que a IL-34 os níveis são elevados no soro, fluido sinovial, e do tecido sinovial de pacientes com AR, e como CSF-1, IL-34 é induzido por TNF e IL-1β na AR sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLS ) [ 35 , 36 , 37 , 38 ]. O objetivo deste estudo foi determinar as contribuições relativas de CSF-1 e IL-34 a CSF1R dependente inflamação na AR.
Métodos
Os pacientes e doadores de tecidos
Biópsias sinoviais foram obtidos por artroscopia agulha conforme anteriormente descrito a partir de articulações clinicamente activo em pacientes com RA (n = 15), artrite psoriática (PSA) (n = 15), ou a osteoartrite (OA) (n = 7), como previamente descrito [ 39 ]. Pacientes com AR e PSA preenchidas as 1987 do American College of Rheumatology critérios para a RA e a classificação dos critérios do estudo artrite psoriática (CASPAR), respectivamente [ 40 , 41 ]. Características clínicas dos pacientes estão detalhadas no arquivo adicionais 1 : Tabelas S1 e S2. Todos os pacientes deram o seu consentimento informado por escrito antes de estudar a inclusão, e este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Centro Médico Acadêmico da Universidade de Amsterdam, e de acordo com a Declaração de Helsinki.
análise de imagens imuno-histoquímica e digitais
As secções em série de seis amostras de biópsia incorporado-TissueTek diferentes por paciente foram cortadas com um criostato (5 uM), fixadas com acetona, e a actividade da peroxidase endógena com peróxido de hidrogénio bloqueado de 0,3% em 0,1% de azida de sódio salino / tamponada com fosfato. As secções foram coradas durante a noite a 4 ° C com Abs contra CSF-1 (R & D), IL-34 (M4, fornecidos por cinco Prime Therapeutics Inc.) e CD68 (Dako). Concentrações equivalentes de Abs monoclonal de ratinho irrelevante foram utilizados como controlos negativos. As secções foram então lavadas e incubadas com peroxidase de cabra anti-ratinho de rábano (HRP) (Dako), excepto no caso do anticorpo anti-IL-34 Ab, o qual foi seguido de incubação com tiramida biotinilado e estreptavidina-HRP. Os cortes foram desenvolvidos com amino-etilcarbazol (AEC, Vector Laboratories), contrastadas com hematoxilina de Gill (Klinipath), e montados em gelatina glicerol de Kaiser (Merck). Secções coradas foram analisadas por análise de imagem assistida por computador, utilizando o sistema de análise de Qwin (Leica) como previamente descrito em detalhe [ 42 ]. Os valores de densidades ópticas integradas (IOD) / mm 2 foram obtidas e corrigidas para o número total de núcleos / mm 2 . Os dados foram apresentados como o número de células positivas / mm 2 para a análise quantitativa de marcadores específicos de células do tipo-.
purificação de monócitos e diferenciação de macrófagos
Células mononucleares humanas foram isoladas de revestimentos de voluntários sangue do dador buffy (Sanquin), do sangue periférico a partir de controlos saudáveis e de pacientes com AR, e a partir de fluido sinovial de doentes com AR através de centrifugação com gradiente de Lymphoprep (Axis-Shield popas) e monócitos foram ainda isoladas por gradiente de Percoll separação (GE Healthcare). Os monócitos foram diferenciadas em macrófagos em IMDM / 10% de soro fetal de vitelo (FCS) suplementado com 100 ug / ml de gentamicina (Invitrogen), na presença de GM-CSF humana (5 ng / ml, R & D Systems), CSF-1 (25 ng / ml, R & D Systems), ou IL-34 (25 ng / ml, fornecida pelo Cinco Prime Therapeutics Inc.) durante 7 dias.
A citometria de fluxo
pureza de macrófagos e diferenciação foram avaliadas por citometria de fluxo (FACS Canto Citómetro de fluxo, BD Biosciences). foram usadas Abs monoclonais marcados com fluorocromo contra CD14 (eBiosciences), CD206 e CD163 (BD Pharmingen, tanto a partir), CD64 (BioLegend), e concentrações equivalentes de Abs de controlo de isotipo. Antes da coloração, receptores de Fc foram bloqueados com 10% de soro humano (Lonza). Os dados foram analisados com o software FlowJo Fluxo de Análise de Citometria (Árvore Star). Os valores foram expressos como a razão entre a intensidade de fluorescência média geométrica (GEOMEAN) do marcador de interesse em relação ao do controlo isotipo.
morte celular de macrófagos e a viabilidade
morte celular de macrófagos foi avaliada por iodeto de (PI) de coloração de anexina V-propídio. GM-CSF-, IL-34-, e macrófagos no sangue periférico de dadores saudáveis e no sangue periférico e líquido sinovial de pacientes com AR CSF-1 diferenciadas foram coradas com Anexina V (diluição de 1: 100, produtos iQ) e PI ( diluição de 1: 100, produtos iQ) e medida usando um FACS Canto citómetro de fluxo. Os dados foram analisados com o software FlowJo Fluxo de Análise de Citometria. Os valores foram expressos como a percentagem de células Anexina V-PI-positivas duas vezes. Macrófagos viabilidade foi avaliada pelo ensaio de calceína. Os monócitos a partir de buffy coat foram diferenciadas em macrófagos com meio sozinho, CSF-1 ou IL-34 e de proliferação celular foi analisada nos dias 1, 3 e 7 por coloração com Calcein-AM (1 uM, BD Bioscience) e análise utilizando um multi leitor -label Victor3 ™ (PerkinElmer Inc.). Os dados foram expressos como sinal em unidades arbitrárias.
quantitativos (q) matrizes de PCR em tempo real (RT) e PCR
ARN a partir de biópsias sinoviais congelados ou de GM-CSF-, e IL-34- macrófagos CSF-1 diferenciadas foi isolado utilizando o Kit RNeasy e isenta de RNase DNase Conjunto (Qiagen). Características clínicas dos pacientes estão detalhadas no arquivo adicionais 1 : Tabela S3. O ARN total foi transcrito reverso usando SuperScript II RT ™ (Invitrogen). Reacções de PCR foram realizadas duplicado utilizando SYBR Green (Applied Biosystems) com um sistema de detecção de sequência ABI 7000 Prism® (Applied Biosystems). DNA complementar (cDNA) foi amplificado utilizando primers específicos (Invitrogen) (ver arquivo adicionais 1 : Tabela S4). Níveis relativos de expressão de genes foram normalizados para a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase ( GAPDH gene de manutenção). O ARN mensageiro expressão (ARNm) foi apresentada como duas -ΔCt ou a quantidade relativa (RQ, 2 -ΔΔCt ). Alternativamente, o RNA total foi sujeito a síntese de ADNc, utilizando um TA 2 kit First Strand (Qiagen) e a expressão de ARNm de 336 genes relacionados com a inflamação foi analisada por RT-qPCR utilizando baixa densidade matrizes qPCR (Factores de crescimento angiogénicos Humano & Angiogenesis Inhibitors, Extracelular Humana matriz & Moléculas de Adesão e TGFß / BMP via de sinalização de PCR Arrays Humanos, Qiagen). Níveis relativos de expressão de genes foram normalizados para cinco genes de manutenção e os valores de RQ determinada como acima.
anticorpos
CSF-1 anti-humano Ab, clone 26730, um neutralizante de ratinho Ab monoclonal IgG2a, foi adquirido a R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EUA. Anti-humano IL-34 Abs M2 e M4 foram fornecidos por cinco Prime Therapeutics. M2 e M4 Abs monoclonais foram preparados por imunização de ratinhos Balb / c com purificada de IL-34 humana produzida em cinco Therapeutics Prime, seguido por procedimentos de hibridoma padrão e purificação de proteínas. Todos os experimentos com animais neste estudo foram realizados em conformidade com os protocolos adequadas aprovadas pelo Comité Cuidado e Uso Institucional animal at Five Prime Therapeutics e Bolder Biopath (Boulder, CO, EUA). O M2 Ab foi determinada como sendo um Ab de bloqueio, e da M4 Ab foi determinada como sendo não-bloqueio Ab por meio de testes sobrenadante de hibridoma quanto à sua capacidade para bloquear biotinilado IL-34 de ligação ao ser humano CSF1R-Fc num formato de ELISA, e testando a capacidade de Ab purificado para neutralizar a sobrevivência dos monócitos humanos primários de IL-34 mediada. CSF1R anti-humano Ab huAB1, um IgG4 humanizado, monoclonal Ab, foi fornecida por cinco Prime Therapeutics. huAB1 bloqueia a ligação de ambos CSF-1 e IL-34 para o CSF1R humano, inibindo desse modo vias de sinalização mediadas por CSF1R (ver arquivo adicional 2 : Figura S1a). Anti-rato CSF1R Ab muAB5, foi fornecida por cinco Prime Therapeutics e é uma IgG1 quimérico, monoclonal Ab consistindo de regiões V de rato e regiões C murino. muAB5 bloqueia a ligação de ambos rato CSF-1 e rato IL-34 ao CSF1R rato, inibindo assim as respostas mediadas pelo CSFR (ver arquivo adicionais 2 : Figura S1b). O tratamento anti-CSF1R em murganhos foi relatado para reduzir selectivamente periféricas Ly6C Lo monócitos não tendo qualquer efeito sobre Ly6C oi números de monócitos [ 6 , 18 ]. Para avaliar o impacto da anti-ratinho CSF1R muAB5 em monócitos periféricos, nos ratinhos tratados com 20 mg / kg de solução salina e muAB5 ou 7 dias depois quantificada populações de monócitos no sangue. Anti-CSF1R muAB5 selectivamente reduzido o número de monócitos Ly6Clo enquanto teve pouco ou nenhum efeito sobre os monócitos Ly6Chi (ver arquivo adicionais 2 : Figura S2).
Ensaios de explantes de biópsia sinovial
Intactas biópsias sinoviais (5 mm 3 ) foram obtidas a partir dos joelhos de pacientes com AR e foram cultivadas, três biópsias por condição, durante 24 h em DMEM completo suplementado com 10% de FCS e estimulados durante 24 h com concentrações crescentes de IL-34 humana ou CSF-1. Alternativamente, os explantes foram cultivados durante 96 horas com anti-humano CSF-1 (5 ug / ml), anti-IL-34 (5 ng / ml, m2), concentrações crescentes de CSF1R anti-humano Ab (huAB1), ou os seus respectivos controlos isotípicos humanos (Eureka Terapêutica). Os sobrenadantes de cultura de tecidos isentos de células foram colhidas para análise de citocina. Características clínicas dos pacientes estão detalhadas no arquivo adicionais 1 : Tabela S4.
A medição da produção de citoquinas
Os sobrenadantes isentos de células a partir de biópsias sinoviais foram analisados por ELISA para IL-6 (kits de ELISA ™ PelKine compacto, Sanquin Reagents). CCL2, CCL-7, ENA-78, SDF-1, MIG, GCP-2, TAC, NAP-2, IP-10, IL-1β, TNF-α, CXCL-8, MMP-2, MMP-7, e MMP-9 foram medidos utilizando os ensaios individuais-Plex humanos (Bio-Rad) e lidas num sistema 200 de Bio-Plex (Bio-Rad).
Efeitos de anti-CSF1R AB em homeostase mielóide murino
Indução e avaliação da CIA e análise histopatológica
Os modelos do rato da CIA foram estabelecidos em Bolder Biopath. Macho DBA / 1 machos (12 / grupo) foram injectados por via intradérmica na base da cauda com 150 uL de adjuvante completo de Freund contendo colagénio bovino tipo II (2 mg / ml) no dia 0 e no dia 21. Para os ratos de tratamento profilático foram doseados , começando no dia 0 com veículo, Enbrel a 10 mg / kg, ou muAB5 a 30 mg / kg. A continuação do tratamento três vezes por semana até ao dia 32. feridas clínicos em uma escala de 0-5 foram determinados para cada uma das patas em dias de estudo 18-35. O estudo foi encerrado no dia 35 e foi colhido sangue.Patas traseiras e joelhos foram coletadas em terminação e processados para análise histológica, conforme detalhado no arquivo adicional 3 : métodos suplementares. Para tratamento terapêutico, os ratinhos foram imunizados como descrito acima e distribuídos aleatoriamente por grupos de tratamento uma vez que, obviamente, o edema foi estabelecidas em, pelo menos uma pata. Pontuações médias de grupo foram 0,5-1,0 (de uma possível pontuação máxima de 5,0) no momento da inscrição. O tratamento com veículo, Enbrel a 10 mg / kg, ou muAB5 a 30 mg / kg foi iniciada após a inscrição e continuou três vezes por semana até ao dia 20 de artrite com ratinhos terminadas no dia 23 de artrite. A exposição a drogas tal como medido pela concentração plasmática terminal estava abaixo do limite de detecção em 3 dos 12 animais no grupo tratado com muAB5. Estas amostras deram resultados positivos para anticorpos anti-droga (dados não mostrados), os quais provavelmente contribuiu para a pobre exposição. Com base nestas descobertas, estas 3 animais com níveis de droga detectáveis foram excluídos de qualquer análise do estudo e interpretação: 7 dos 12 animais no grupo tratado com Enbrel também não tinha fármaco detectável na terminação e foram excluídos da análise.
análise TRAP5b
banda de soro de rato 5 tartarato resistente fosfatase ácida isoforma b (TRAP5b) foi medida no ratinho de plasma EDTA utilizando um kit de ELISA comercial (ratoeira ™ Assay, Immunodiagnostic Systems, Inc.) de acordo com as instruções do fabricante, incluindo uma diluição de 1: 4 de todos As amostras de plasma, utilizando em vez de soro. Cada amostra foi testada em singuleto. A curva de absorção padrão vs. dados de concentração foram ajustados a uma logística de quatro parâmetros para o cálculo dos resultados do ensaio.Os resultados são reportados em unidades / litro (L / G).
análise estatística
A análise estatística foi realizada usando o Windows GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). As diferenças de potencial entre os grupos experimentais foram analisados pelo teste de Mann-Whitney não paramétrico U de teste, teste de Kruskal-Wallis, Friedman ou teste emparelhado, como adequado. P valores <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Resultados
expressão tecido sinovial de CSF-1, IL-34 e CSF1R
Em primeiro lugar, investigou-se a expressão de CSF-1, IL-34 e CSF1R no tecido sinovial de pacientes com AR ou PSA opcionais. análise qPCR não identificou diferenças entre pacientes com AR e PSA na expressão de mRNA de IL-34, CSF-1, ou seus receptores (Fig. 1a ). A análise imunohistoquímica do tecido sinovial independentemente confirmado que a IL-34 (Fig. 1b ) e CSF-1 (Fig. 1c ) são expressas em tecido sinovial na AR, AP e de OA. Enquanto a IL-34 é expresso no sublining sinovial e a camada de revestimento da íntima, CSF-1 expressão foi limitada principalmente para as áreas em torno dos vasos sanguíneos. Na quantificação digital coloração para cada citocina, IL-34 e CSF-1 expressão da proteína foi semelhante em tecido sinovial na AR, AP e OA (Fig. 1d ). Em conjunto, estes dados demonstram que tanto a IL-34 e CSF-1 são expressos em níveis semelhantes na membrana sinovial de pacientes com artrite inflamatória e não inflamatória.
FIG. 1
Factor estimulante de colónias-1 (CSF-1), IL-34 e receptor de CSF1 ( CSF1R ) são expressas em tecido sinovial de pacientes com artrite reumatóide ( AR ) e artrite psoriática ( PsA ). Uma quantificação de IL-34, FEC relativa expressão -1 e mRNA CSF1R no tecido sinovial a partir de 6 pacientes com AR e 6 com APs. Os dados de PCR quantitativas são mostradas como quantidade relativa ( RQ ), conforme descrito em " Métodos ". Os dados são apresentados como gráficos de dispersão, em que cada trama representa um valor individual, barras representam a média, e as barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM). B , c imunohistoquímica análises de AR, AP e de tecido sinovial OA coradas com controle coelho, anti-IL34 ( b ) e anticorpos anti-CSF1 ( c ). d análise quantitativa de IL-34 e CSF-1 coloração no tecido sinovial. Seções sinoviais de 15 pacientes com AR, 15 com AP e 7 pacientes com osteoartrite ( OA ) foram coradas com anticorpos contra a IL-34 e CSF-1 anticorpos como acima, e a densidade óptica integrada ( IOD / mm 2) corrigidos para celularidade foi calculada por análise de imagem digital. Cada loterepresenta um valor individual, barras representam a média e barras de erro indicam o SEM. * P <0,05
IL-34 e CSF-1 induzem padrões de expressão gênica similares, mas distintas em macrófagos humanos
Dado que a IL-34 e CSF-1 localizada em regiões distintas da membrana sinovial e macrófagos em camadas sublining e forro da íntima sinoviais RA e PSA exibir características fenotípicas distintas [ 43 ], foi examinada a influência destas duas citocinas no sangue periférico a partir de HD e pacientes com AR, e sua influência na diferenciação sinovial derivadas de fluido de monócitos, proliferação e expressão de genes em RA. Para testar isto, nós diferenciadas monócitos a partir de células mononucleares de buffy coat em sangue de HD, e sangue periférico e no fluido sinovial de doentes com RA com CSF-1 (CSF-1 MO), IL-34 (IL-34 MO) ou GM -CSF (GM-CSF MO). Em primeiro lugar, analisaram o efeito de IL-34 e CSF-1 sobre a proliferação de macrófagos e sobrevivência. Nós não observaram diferenças na sobrevivência das células em IL-34 MO e CSF-1 MO; no entanto, houve uma tendência para uma maior morte celular em comparação com GM-CSF MO (Fig. 2a ). Não foi observada qualquer diferença na viabilidade celular entre macrófagos derivados de células mononucleares no sangue periférico de HD ou de pacientes com AR, nem entre e macrófagos derivados de líquido sinovial em pacientes com AR (Fig. Derivadas de sangue periférico 2a ). Nós também descobrimos que tanto CSF-1 e IL-34 promoveu a sobrevivência de células da mesma forma, e aumentou significativamente a viabilidade em relação à macrófagos diferenciados em meio sozinho ( p <0,05, veja arquivo adicionais 2 : Figura S3).
FIG. 2
IL-34 e factor estimulante de colónias-1 ( CSF-1 macrófagos) têm características fenotípicas semelhantes. Umacélula activado por fluorescência (FACS) de anexina iodeto de V-propídio ( PI manchamento) nos macrófagos diferenciados durante 7 dias em granulócitos-macrófagos factor estimulante de colónias ( GM-CSF ) (5 ng / mL), CSF-1 (25 ng / ml) ou IL-34 (25 ng / ml) a partir de sangue periférico e no fluido sinovial de dadores saudáveis ( HD ) e pacientes com artrite reumatóide (AR). Os dados são apresentados como percentagem de células positivas duas vezes e representam a média ± erro padrão da média (SEM) de 3-4 experiências independentes. B , c análise por FACS da expressão de marcadores de superfície de macrófagos CD14, CD163, CD206, CD64 e em macrófagos diferenciados durante 7 dias em GM-CSF, CSF-1 ou IL-34 derivada de monócitos de buffy coat ( b ) ou de monócitos de sangue periférico de HD ou pacientes com AR ( OP ), ou a partir de fluido sinovial de pacientes com AR ( SF ) ( C ).Os dados são apresentados como a média geométrica ( geo significar ) e representam a média ± SEM de 4-5 experiências independentes por marcador. * P <0,05, ** P <0,01 e *** P <0,001
Em seguida, examinámos a expressão de marcadores de polarização recentemente validados para os macrófagos humanos [ 43 ]. Observou-se que a expressão de CD14, CD163, CD206 e CD64 foi semelhante em IL-34 MO e CSF-1 MO, independentemente se os macrófagos foram obtidos a partir de sangue periférico a partir de HD, ou sangue periférico ou fluido sinovial de pacientes com AR. Em contraste, o GM-CSF tinha MO expressão significativamente mais baixa de CD14 e CD163, e de expressão elevada de CD206 e CD64 (Fig. 2be na Fig. 2c ).
Finalmente, examinámos a expressão de ARNm de 336 genes relevantes para RA, envolvidos na angiogénese, remodelação da matriz extracelular e a formação de osteoclastos. Na análise clustergrama sem supervisão, GM-CSF MO derivada a partir de sangue periférico a partir de HD agrupado distintamente diferenciada em comparação com aqueles da IL-34 ou de FEC-1 (Fig. 3a ), como esperado. IL-34 e CSF-1 MO estavam intimamente relacionadas, com mais diferenças globais entre doadores de monócitos do que a citocina usado para diferenciação. No entanto, apesar da forte relação na expressão genética entre macrófagos diferenciados em IL-34 e CSF-1, que identificou uma série de genes que foram significativamente upregulated no CSF-1 MO, incluindo CXCL5 , Tie1 , LMBP2 , Cdc25A , ITGA6 , LAMAC1 , ECM1 , e ITGB5 (Fig. 3a ). Em contraste, a expressão de CXCL12 , SERPINF1 , MMP2 , ACVRA2 , ITGAL , CDH11 , e TGFBR3 foi significativamente sobre-regulada de IL-34 MO (Fig. 3b e arquivo adicional 1 : Tabela S5). Nós também examinou se IL-34 e CSF-1 MO diferenciado do líquido sinovial (SF) monócitos na AR tinham diferentes padrões de expressão em genes relacionados com a remodelação da matriz extracelular. Observamos regulação positiva de ADAMTS1 , MMP3 , MMP7 , ITGA1 , LAMA1 , LAMA3 , LAMB3 e SSP1 no CSF-1 MO, enquanto CDH11 , MMP2 e ITGB4 foram upregulated em IL-34 MO (Fig. 4 ). Juntos, estes resultados sugerem que, embora a IL-34 e CSF-1 geram macrófagos fenotipicamente semelhantes, localizada diferencial de produção de IL-34 e CSF-1 na sinóvia pode potencialmente dar origem a macrófagos com capacidades funcionais discretos.
FIG. 3
A expressão de genes em macrófagos diferenciados. Um perfil de expressão de ARNm de 336 genes envolvidos na angiogénese, remodelação da matriz extracelular, e a formação de osteoclastos em factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos ( GM-CSF ) -, factor estimulante de colónias-1 ( CSF-1 ) macrófagos ou IL-34 diferenciadas (MO) derivadas de monócitos de cremes leucocitários (n = 3) -. Os dados são apresentados em uma clustergrama sem supervisão. B As análises dos níveis de genes selecionados analisados na expressão de mRNAum . Os dados são apresentados como a quantidade relativa ( RQ ) em relação a GM-CSF MO, conforme descrito em " Métodos "
FIG. 4
A expressão de genes em macrófagos diferenciados a partir de monócitos de fluido sinovial na artrite reumatóide (AR). As análises dos níveis de genes envolvidos na formação de remodelação da matriz extracelular na expressão de ARNm de factor estimulante de colónias-1 ( CSF-1 ) - macrófagos ou IL-34 diferenciadas (MO) derivada a partir de monócitos de fluido sinovial na AR (n = 3). Os dados são apresentados como a quantidade relativa ( RQ ) em CSF-1 MO, conforme descrito em " Métodos ". * P <0,05
CSF1R bloqueio reduz a produção de mediadores inflamatórios em tecido sinovial RA
Para estender o nosso conhecimento sobre o papel da CSF1R sinalização na AR, foram utilizados anticorpos bloqueadores para CSF-1 (clone 26730), a IL-34 (M2), ou para CSF1R (huMab1) para investigar os efeitos diferenciais de respostas de inibição para cada ligando de forma independente em relação a inibição de respostas ambos os ligandos, simultaneamente, por meio do bloqueio CSF1R. Em primeiro lugar, determinado o efeito da estimulação de IL-34 e CSF-1 na produção de citocinas em tecido sinovial RA. As experiências iniciais demonstraram que a adição de ambos IL-34 ou de FEC-1 não induziu a produção de IL-6 por Ra explantes sinoviais (Fig. 5a ). Para descartar a possibilidade de que o receptor de tipo proteína-tirosina ζ fosfatase (PTP-ζ), uma descoberta recente de IL-34 do receptor [ 44 ], poderia interferir na produção de IL-6, analisou-se a expressão do mRNA no tecido sinovial de pacientes com AR ou AP. Descobrimos que PTP-ζ foi expressa na membrana sinovial em ambas as doenças (ver arquivo adicionais 2 : Figura S4), ainda que em níveis muito baixos em comparação com CSF1R. Além disso, a neutralização de qualquer IL-34 sozinha (Fig. 5b ) ou de CSF-1 sozinho (Fig. 5c ) não influenciou a produção de IL-6 por explantes sinoviais. No entanto, a segmentação directa de CSF1R com huAb1, que bloqueia a ligação de IL-34 e CSF-1, significativamente reduzida explante sinovial de IL-6 a produção de uma forma dependente da dose, com uma inibição máxima já foi observado a uma concentração de Ab de 1 ug / ml (Fig. 5d ). huAB1 também reduziu significativamente a produção das quimiocinas CXCL-8, GCP-2, MIG, IP-10, CCL-2, CCL-7 e MMP-9 em tecido sinovial RA (Fig. 5e ), e observou-se uma tendência para uma redução na produção de TNF, IL-1β, ENA-78 e MMP-2, embora as diferenças não foram significativas (Fig. 5f ). Em contraste, não foram observadas diferenças na produção de SDF-1, TAC, NAP-2, e MMP-7 (dados não mostrados). Juntos, estes resultados demonstram que a inibição de sinalização CSF1R, mas a inibição não individual dos dois ligandos do receptor, é capaz de reduzir a produção de mediadores inflamatórios no tecido sinovial na AR.
FIG. 5
Estimulante do receptor anti-colónia factor-1 (anti-CSFR1) anticorpo reduz a produção de mediadores inflamatórios no tecido sinovial na artrite reumatóide (AR). Uma produção de ELISA de IL-6 nos sobrenadantes de tecido sinovial RA após 24 horas de incubação em meio sozinho ou concentrações crescentes de factor estimulante de colónias-1 (CSF-1 ) ou IL-34 (N = 7). b - d da IL-6 de produção de ELISA em sobrenadantes de tecido sinovial RA após 4 dias de incubação em meio sozinho na presença de IgG1 ou anti-IL-34 anticorpo (Ab) (5 ug / ml para ambos, n = 5) ( B ), anti-CSF-1 Ab (5 ug / ml, n = 3) ( c ), ou concentrações crescentes de IgG4 ou huAB1 (n = 5) ( d ). e , F análise multiplex de produção de proteína nos sobrenadantes de tecido sinovial RA após 4 dias de incubação em meio sozinho na presença de 1 ug / IgG4 ml ou 1 ug / ml huAB1 (n = 4). caixas representam os percentis 25-75th, linhas dentro das caixas de marcar o valor mediano e linhas fora das caixas representam os percentis 10 e 90. * P <0,05 e ** P <0,01
bloqueio CSF1R é protetora na CIA
Dada a eficácia do bloqueio CSF1R em tecido sinovial RA, examinámos o efeito do bloqueio anti-rato CSF1R muAB5 anticorpo in vivo utilizando o modelo de murídeo de artrite CIA. A administração profilática de muAB5 (30 mg / kg) reduziu significativamente a gravidade da artrite em comparação com o controlo de veículo (Fig. 6a ). As análises histológicas das patas traseiras dos ratinhos confirmou o efeito protector de muAB5, como as pontuações para a inflamação, danos na cartilagem, formação de pannus e erosão de osso foram todas melhoradas nos ratinhos tratados com muAB5 (Fig. 6b ). A análise semiquantitativa demonstrou que a administração muAB5 reduziu drasticamente e significativamente todos estes parâmetros analisados (Fig. 6c). Como a sinalização CSF1R também suporta osteoclastogênese, quantificamos os níveis séricos do marcador de reabsorção óssea, TRAP5b. Ratinhos tratados com anti-CSF1R tiveram uma redução significativa na TRAP5b comparação com ratinhos tratados com veículo (Fig. 6d ). Curiosamente, a administração de muAB5 foi mais eficaz do que o Enbrel (10 mg / kg) na redução da gravidade da artrite e na melhoria de todos histológico, radiológico, e parâmetros serológicos (Fig. 6A-D ). Tratamento anti-CSF1R foi associada a uma redução infiltração de macrófagos no tecido sinovial (Fig. 6e ). As patas dianteiras e joelhos dos ratinhos foram examinados por análise de imuno-histoquímica para a presença de macrófagos por F4 / 80 coloração.Números de macrófagos foram significativamente reduzidos em ratinhos tratados com muAB5 em comparação com controlo de veículo. Enbrel não teve efeito significativo sobre os números de macrófagos nos tecidos.
FIG. 6
O tratamento profilático com anti-receptor de factor de estimulação de colónias-1 ( anti-CSF1R ) impede a progressão patológica na artrite induzida por colagénio ( CIA ). Um diárias pontuações artríticas globais para ratos tratados intraperitonealmente a cada 3 dias com veículo, Enbrel, ou muAb5. O tratamento continuou três vezes por semana desde o dia 0 com veículo de controlo ( triângulos ), Enbrel (10 mg / kg) ( círculos ) ou muAb5 (30 mg / kg) (quadrados ). B Imagens representativas de aparências patológicas das articulações no tratamento indicado grupo, visualizadas por coloração com H & e. Nota as áreas representativas de infiltração celular sinovial e formação de pannus ( setas ). C inflamação ( I ), formação de pannus ( PF ), danos na cartilagem ( CD danos osso (), e BDcontagens) para ratinhos em cada grupo de tratamento. Os dados são média ± erro padrão da média (EPM) para cada grupo (n = 12 animais por grupo). # P <0,05 vs veículo e ** P <0,01. D , e Banda 5 tartarato resistente fosfatase ácida isoforma b ( TRAP5b ) níveis plasmáticos ( d ) e o número de células F4 / 80-positivos em cinco × 200 campos (e ) nas articulações inflamadas de ratinhos em cada grupo de tratamento. os símbolos representam os valores obtidos a partir de animais individuais, barras representam a média e erro barras indicam o SEM. # P <0,05 vs ingênuo e ### P <0,001 vs naïve. *** P <0,001
A seguir, analisou o efeito terapêutico do tratamento muAB5 no modelo CIA. muAB5 administrado após a indução de artrite significativamente inibiu a formação de pannus e destruição do osso (Fig. 7a ). Tratamento anti-CSF1R não têm um efeito significativo sobre os parâmetros histológicos de inflamação ou destruição da cartilagem. Neste estudo Enbrel também não teve nenhum efeito significativo sobre a inflamação da cartilagem ou destruição. O tratamento terapêutico com TRAP5b soro muAB5 também reduzido e o número de macrófagos dos tecidos (Fig. 7b e 7c ). A falta de um efeito de muAB5 sobre a inflamação, apesar de reduzir os números de macrófagos de tecido, é possivelmente devido ao facto de que a inflamação de fase final no modelo de ratinho CIA é em parte devido à alta infiltração de neutrófilos. Isto está em contraste com a AR humana em macrófagos que predominam.
FIG. 7
O tratamento terapêutico com anti-estimulação de colónias de receptor do factor-1 ( anti-CSF1R ) suprime a destruição óssea e formação de panos na artrite induzida por colagénio ( CIA ). Uma avaliação histopatológica de CIA em ratinhos tratados com veículo, Enbrel, ou muAB5 após o início do artrite. * P <0,05 e ** P <0,01 vs veículo. Iinflamação, PF formação de pannus, CD danos na cartilagem, BD osso danos. B , c da faixa 5 de fosfatase ácida isoforma b (resistente ao tartarato TRAP5b ) níveis plasmáticos ( b ) e número de células / 80-positivos F4 em cinco × 200 campos ( c ) nas articulações inflamadas de ratinhos em cada grupo de tratamento. os símbolos representam os valores obtidos a partir de animais individuais, barras representam a média, e as barras de erro indicam o erro padrão da média. ** P <0,01 vs veículo e ### P <0,001 vs naïve. *** P <0,001
Discussão
No presente estudo, foi demonstrado que os anticorpos específicos contra CSF1R, que impedem a ligação de ambos CSF-1 e IL-34 ao seu receptor, reduzir a gravidade da CIA e a produção de mediadores inflamatórios na AR explantes de tecido sinovial ex vivo. Por outro lado, a neutralização de CSF-1 ou IL-34 teve individualmente nenhum efeito detectável na expressão de genes inflamatória no tecido sinovial RA. Esta última observação foi surpreendente, como CSF-1 ou deficiência de neutralização em modelos animais de RA tem efeitos terapêuticos claros [ 11 , 12 ]. Os nossos dados podem sugerir que na CIA, CSF-1 desempenha um papel importante na promoção da diferenciação e sobrevivência de monócitos maduros na periferia antes ou em que estão a entrar no tecido inflamado, tal como observado em certos modelos murinos de pulmão e inflamação peritoneal [ 6 ], enquanto na AR explantes sinoviais, macrófagos sinoviais já não depende estão sobre CSF-1 sozinho. Em vez disso, os macrófagos podem também utilizar sinoviais de IL-34 como um factor de sobrevivência. Em conformidade com isso, CSF-1 e IL-34 são detectados em concentrações equivalentes em fluido sinovial de pacientes com AR, e aqui que confirmam e ampliam as observações anteriores de que tanto o CSF-1 e IL-34 são produzidas localmente na AR tecido sinovial [ 35 , 36 ]. No entanto, a estimulação de Ra biópsias sinoviais, quer com o CSF-1 ou IL-34 não conseguiu influenciar a expressão aguda de mediadores inflamatórios, possivelmente indicando que a produção sinovial endógena de CSF-1 e / ou IL-34 em RA é saturação no que diz respeito à disponibilidade CSF1R .
A nossa incapacidade para modular a expressão do gene AR explante sinovial por neutralização de CSF-1 e IL-34 suporta individualmente ainda mais a noção de que estas duas citocinas são largamente redundante no apoio a diferenciação e a sobrevivência da maior parte das populações de macrófagos de tecido. Algumas diferenças subtis foram observadas entre o CSF-1 e IL-34 na força e a cinética com os quais eles activam CSFR1 [ 30 , 31 , 32 ]. De facto, a análise da expressão do gene mundial de monócitos humanos diferenciados com IL-34 e M-CSF, revelou que dos genes regulados por estas citocinas, as diferenças quantitativas na indução foram observados cerca de 30% dos genes [ 45 ]. Consistente com isto, de 336 genes envolvidos em processos que contribuem para as alterações patológicas na AR, tais como angiogénese, inflamação e remodelação de tecidos, observou-se apenas 18 genes que foram diferencialmente expressos por CSF-1 e IL-34 MO. No entanto, como se observa que CSF-1 (detectado em células que rodeiam os vasos sanguíneos) e IL-34 (ao longo das camadas sublining e forro da íntima sinoviais) são expressos em diferentes regiões da membrana sinovial, estas citocinas poderiam potencialmente contribuir para a heterogeneidade fenotipica de macrófagos observados nos sublining e forro íntima camadas de membrana sinovial em artrite inflamatória [46 ].
Nossos resultados fornecem a primeira evidência direta de que a segmentação de CSF1R tem efeitos anti-inflamatórios em não só animal, mas também modelos humanos de AR estabelecida. Estudos anteriores observaram efeitos protetores contra alterações patológicas em modelos animais de RA utilizando inibidores farmacológicos da atividade CSF1R quinase [ 22 , 23 ]. No entanto, foram levantadas questões que estes compostos podem também atingir outras tirosina-quinases relevantes para alteração patológica na AR [ 17 ].Enquanto este manuscrito estava em preparação, Toh e seus colegas relataram que outra Ab específico do CSF1R poderia profilaticamente prevenir a inflamação e lesão das articulações em CIA [ 47 ]. Curiosamente, o mesmo anticorpo não suprimiu a inflamação no modelo de transferência de soro murino de artrite, enquanto retendo a sua capacidade de bloquear a cartilagem e osso destruição. Os autores atribuíram esta discrepância potencialmente diferencial papéis para recrutamento de macrófagos e ativação nesses modelos animais [ 47 ].
Da mesma forma, resultados conflitantes utilizando diferentes anticorpos bloqueadores CSF1R em outros modelos de doenças animais levaram a dúvidas sobre a viabilidade desta estratégia [ 17 ]. Por exemplo, o anti-Ab CSFR1 AFS98, o que reduz rapidamente monócitos e macrófagos de tecidos in vivo, confere protecção em modelos de murídeo de inflamação do pulmão e peritoneal [ 6 ]. No entanto, outro Ab M279, o que reduz os F4 / 80 hi Ly6 lo população de monócitos e macrófagos teciduais mais lentamente, não exibe efeitos anti-inflamatórios em modelos similares, mas agrava doença do enxerto contra hospedeiro [ 18 ]. A diferença na actividade de AFS98 e M279 poderiam ser devido a diferenças na função efectora de Fc [ 17 ]. AFS98 é uma IgG2a de rato com maior potencial para a função efectora de Fc em comparação com M279, que é uma IgG1 de rato. muAb5 é um IgG1 de rato e espera-se que têm baixa função efetora Fc, similar ao M279. Em nosso estudo, muAb5 reduzida a mesma população de monócitos circulantes observado com M279, mas forneceu proteção quase completa contra todos os parâmetros da doença em CIA.
Estes estudos levaram à sugestão de que em algumas doenças inflamatórias, a terapia anti-CSF1R pode agravar alterações patológicas, esgotando o tecido dos macrófagos teciduais residentes tolerizante e permitindo a sua substituição por populações de monócitos pró-inflamatórias, ou através da promoção da re pró-inflamatória polarização de macrófagos teciduais [ 17 ]. Estas preocupações só pode ser dirigida empiricamente na clínica, mas é de notar que o tratamento huAB1 reduziu a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, TNF, e IL-1), quimiocinas (CXCL-8, GCP-2, MIG , IP-10, CCL-2, e CCL7), e das MMPs (MMP-2 e MMP-9) em tecido sinovial RA. Isto sugere que o bloqueio CSF1R no tecido inflamado não resulta na conversão dos macrófagos sinoviais a um fenótipo funcional mais pró-inflamatória, consistente com observações recentes de que os estímulos ambientais presentes no tecido sinovial, tais como complexos de IgG e angiopoietinas, pode substituir as condições de polarização para regulam a expressão do gene de macrófagos [ 48 , 49 ]. Experimentação em biópsias sinoviais não pode abordar a possibilidade de que monócitos circulantes pró-inflamatórias pode substituir macrófagos sinoviais após o tratamento anti-CSF1R, mas os estudos de migração de monócitos usando a cintilografia em pacientes com AR indicou que a rotatividade de macrófagos no tecido sinovial é lento, e mesmo durante a terapia bem sucedida , a taxa de imigração de monócitos em tecido sinovial é inalterada [ 50 , 51 ], levantando a possibilidade de que o CSF-1 mantém populações distintas em monócitos do rato e do homem.
conclusões
interferência simultânea com CSF-1 e IL-34 para a sinalização CSF1R suprime a expressão de pró-inflamatória gene em tecido sinovial RA, e diminui a patologia em ambas as estratégias de tratamento profiláticos e terapêuticos na CIA, validando o CSF1R como um potencial alvo terapêutico na AR.
abreviaturas
AB:
anticorpo
CIA:
artrite induzida por colagénio
ADNc:
ADN complementar
CSF:
-factor estimulante de colónia
CSF1R:
colony - estimular o receptor do factor-1
DMEM:
meio de Eagle modificado por Dulbecco
EDTA:
ácido etilenodiaminotetracético
ELISA:
ensaio imunossorvente ligado a enzima
FACS:
separação de células activada por fluorescência
FCS:
soro fetal de vitelo
FLS:
sinovi�ito fibroblastos-like
GAPDH:
desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato
GM-CSF:
granulokine-macrófagos
HD:
dador saudável
HRP:
peroxidase de rábano
ELE:
hematoxilina e eosina
IOD:
densidades ópticas integradas
IL:
interleucina
MMP:
metaloproteinases da matriz
mRNA:
RNA mensageiro
OA:
osteoartrite
PI:
iodeto de propídio
AP:
artrite psoriática
RA:
artrite reumatóide
RQ:
quantidade relativa
RT-qPCR:
Em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa
SF:
fluido sinovial
TNF:
fator de necrose tumoral
TRAP5b:
banda de 5 resistente ao tartarato fosfatase ácida isoforma b
declarações
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada por uma bolsa de investigação aberto das Cinco Therapeutics Prime, Inc. para KAR.
Acesso AbertoEste artigo é distribuído sob os termos da Licença Internacional 4.0 Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ), que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que você dê crédito apropriado ao autor original (s) e da fonte, fornecer um link para a licença Creative Commons, e indicar se as alterações foram feitas. A renúncia Dedicação Creative Commons Public Domain ( http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/ ) aplica-se aos dados disponibilizados neste artigo, salvo indicação contrária.
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